張亞龍，尤嘉琮

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300052，

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)病率最高，死亡率居于各類腫瘤之首[1]。從循證醫(yī)學(xué)的角度分析，針對NSCLC的治療應(yīng)根據(jù)患者的具體情況，如患者機(jī)體狀況、病理分型以及腫瘤侵犯部位及發(fā)展情況進(jìn)行綜合的評價(jià)，從而制訂出合理有效的治療方案。既往的研究發(fā)現(xiàn)，在約40%～80%的NSCLC患者組織中存在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的過度表達(dá)[2]，同時EGFR突變也多發(fā)生于NSCLC患者中。選擇以EGFR作為靶點(diǎn)治療NSCLC患者，在臨床上取得了較為理想的效果。早期針對該靶點(diǎn)的藥物主要可分為單克隆抗體以及小分子的抑制劑，其中以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)在上市初期對具有EGFR突變的NSCLC患者的療效十分顯著。但長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，有一部分患者對EGFR-TKIs藥物治療并不敏感，部分會在治療一段時間之后，發(fā)生敏感性逐漸降低直至最后出現(xiàn)耐藥性。目前，EGFR-TKIs仍然是治療NSCLC的理想藥物，靶向耐藥有關(guān)的分子研究輔助EGFR-TKIs治療NSCLC是一個新的重要的研究內(nèi)容。

1 EGFR-TKIs作用途徑

EGFR屬于表皮生長因子基因(ErbB)受體家族，是跨膜蛋白的一種，由1186個氨基酸組成，分子質(zhì)量為170kD。EGFR包括三個區(qū)域：胞外配體結(jié)合區(qū)、酪氨酸激酶活性區(qū)和跨膜區(qū)。胞外配體結(jié)合區(qū)的主要結(jié)合區(qū)域位于294至543位氨基酸。酪氨酸激酶活性區(qū)又分為近膜亞區(qū)、酪氨酸激酶亞區(qū)和碳端亞區(qū)，其中的酪氨酸激酶亞區(qū)含有ATP的結(jié)合位點(diǎn)，EGFR-TKIs的競爭結(jié)合靶點(diǎn)之一，通過與此靶點(diǎn)的結(jié)合可阻斷配體與受體結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]?？缒^(qū)可將受體固定于細(xì)胞膜上。

當(dāng)EGFR的胞外區(qū)域和其配體結(jié)合，例如EGF或者轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)，可與其他EGFR或者HER等家族成員形成二聚體，使得EGFR自身可以進(jìn)行自主性磷酸化，同時激活主要的酪氨酸殘基。在此形成的磷酸化EGFR進(jìn)一步激活下游與細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡有關(guān)通路，如P13K/AKT/mTOR，RAS/RAF/MAPK，JAK/STAT等通路[4-11]。由EGFR基因的突變引起的信號通路的結(jié)構(gòu)性激活已經(jīng)被證實(shí)與NSCLC腫瘤的形成、發(fā)展以及不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。EGFR激活突變區(qū)域主要位于酪氨酸激酶區(qū)的18-21外顯子區(qū)域，主要包括19外顯子的缺失突變(delE746-A750)，缺失幾率為45%；21外顯子易出現(xiàn)點(diǎn)突變(L858R)，其突變幾率為40%～45%；18外顯子出現(xiàn)點(diǎn)突變(G791X)幾率為5%；20外顯子主要以插入突變?yōu)橹?，幾率?%[13]。EGFR所出現(xiàn)的基因突變中，19外顯子突變發(fā)生在EGFR與ATP結(jié)合區(qū)域，突變造成ATP的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變；21外顯子的L858R突變，促使酪氨酸激酶長期處于活化狀態(tài)，而L719S突變引起非活化構(gòu)象去穩(wěn)定化，結(jié)果造成EGFR持續(xù)被激活，使得原先的ATP結(jié)合位點(diǎn)與TKI結(jié)合早于ATP，由此阻斷下游與細(xì)胞生長有關(guān)的信號傳導(dǎo)。以上EGFR發(fā)生的突變這些突變均能增加癌細(xì)胞對EGFR-TKIs的敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼、埃羅替尼等EGFR-TKIs藥物對EGFR突變患者的有效率高達(dá)75%[14]。因此，在臨床采用吉非替尼治療NSCLC的一個重要依據(jù)便是觀察患者是否出現(xiàn)EGFR突變。

1.1 EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥的分子靶向研究 在EGFR-TKIs成為治療NSCLC患者的主要藥物之后，耐藥性的出現(xiàn)使得治療又出現(xiàn)一定的局限性。多數(shù)的具有EGFR突變的腫瘤患者，在藥物初始治療后的12個月左右出現(xiàn)了耐藥性。目前已有多種EGFR-TKIs耐藥相關(guān)誘因被證實(shí)，包括EGFR自身耐藥性突變，T790M突變，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal-epithelial transition factor，MET)原癌基因擴(kuò)增及其蛋白過度表達(dá)，EGFR配體中又存在HGF和PTEN缺失，KRAS、BRAF和HER-2突變，上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞生長相關(guān)信號通路信號缺失，AXL過表達(dá)等因素[15-21]。針對上述的耐藥因素，早有研究人員根據(jù)其耐藥機(jī)制將其分為原發(fā)性耐藥與獲得性耐藥[22]，其中獲得性耐藥又分為對EGFR具有依賴性的耐藥與不具有依賴性的耐藥[23]，但二者均包含有組織或細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)改變及突變，近期在以往關(guān)于耐藥基因研究的基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)新的與耐藥相關(guān)的基因。

Balak MN等[22]研究者發(fā)現(xiàn)，部分患者在初次使用EGFR-TKIs藥物治療一段時間后，對于癥狀及存活率并無明顯改善，這部分患者即可被視為對EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥。并且在EGFR突變的NSCLC患者群體中，此類患者也占有一定比例。早期針對原發(fā)性耐藥原因的研究發(fā)現(xiàn)，同時出現(xiàn)的藥敏突變與基因突變，與EGFR信號傳導(dǎo)有關(guān)的基因發(fā)生突變使細(xì)胞信號傳導(dǎo)中斷，患者機(jī)體免疫方面的變化等均會導(dǎo)致NSCLC患者原發(fā)性耐藥，KRAS基因突變也可以導(dǎo)致EGFR-TKIs原發(fā)耐藥。SOX2基因與EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥密切相關(guān)，使用PI3K/Akt抑制劑可以抑制SOX2基因表達(dá)，從而增加NSCLC細(xì)胞對EGFR-TKIs的敏感性[24]。Nozaki等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在EGFR-TKIs原發(fā)耐藥性肺癌細(xì)胞中，DDX3X作為一種ATP依賴性的RNA解旋酶，其表達(dá)可以促進(jìn)SOX2表達(dá)，出現(xiàn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使癌細(xì)胞出現(xiàn)如細(xì)胞獨(dú)立增殖分化能力等類似腫瘤干細(xì)胞的表型，而由此增殖分化出的細(xì)胞均具有EGFR-TKIs抗性。CRIPTO1是EGF-CFC家族一員，在對EGFR-TKIs耐藥的EGFR突變型NSCLC患者中檢測到CRIPTO1表達(dá)顯著升高，當(dāng)敲除CRIPTO1后對厄洛替尼耐藥的細(xì)胞出現(xiàn)了厄洛替尼敏感性表型[26]，說明CRIPTO1可能是治療EGFRTKIs耐藥性患者的一個潛在靶點(diǎn)。

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是纖維蛋白溶酶原家族成員，具有活化MET的功能。HGF/MET通路可參與血管、組織形成以及免疫活性調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)HGF/MET通路參與到EGFR突變的NSCLC原發(fā)性耐藥與繼發(fā)性耐藥中。在EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥的細(xì)胞系中，檢測到HGF過度表達(dá)而推測HGF可能會通過激活MET，使其介導(dǎo)下游的PI3K-Akt信號通路激活，降低EGFRTKIs對信號傳導(dǎo)的抑制能力[27]。通過建立對EGFRTKIs耐藥MET激活的細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，在MET大量被激活的細(xì)胞中，EGFR-TKIs對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用將大大削弱[28]。近期研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以使酪氨酸激酶失活，繼而造成EGFR-TKIs的原發(fā)性耐藥，并且HGF還可以促使腫瘤蛋白與EGFR之間的相互作用，于是在治療EGFR-TKIs原發(fā)耐藥性治療預(yù)先使用HGF/MET的抑制劑可能會防止耐藥現(xiàn)象的發(fā)生[29]。

1.2 EGFR-TKIs獲得性耐藥的分子靶向研究 獲得性耐藥是目前治療EGFR突變的NSCLC患者主要障礙之一，也是目前NSCLC治療無論是無進(jìn)展生存期短還是生存率低的主要原因。EGFR-TKIs獲得性耐藥是指經(jīng)過EGFR-TKIs治療后，一般在6～14個月左右腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者出現(xiàn)新的進(jìn)展。

由于基因二次突變是在用藥過程中產(chǎn)生而被檢測到的，所以被認(rèn)為是獲得性耐藥的首要機(jī)制。T790M突變是最常見的EGFR-TKIs獲得性耐藥性誘因，在EGFR基因的CpG二核苷酸出現(xiàn)了堿基C向T的轉(zhuǎn)換。其機(jī)制主要是由于T790M突變是EGFR基因20外顯子第790位點(diǎn)由一個龐大體積的蛋氨酸(M)替代蘇氨酸(T)，出現(xiàn)了位阻效應(yīng)，減弱了與EGFR的ATP結(jié)合力，另外T790M突變增加了EGFRL858R突變體與ATP的親和力，而產(chǎn)生對TKI的獲得性耐藥[30]。在TKI耐藥性的EGFR突變患者中T790M出現(xiàn)的幾率高達(dá)50%[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，T790M可直接影響藥物發(fā)揮作用，當(dāng)患者被檢測到出現(xiàn)T790M突變后，即出現(xiàn)對厄洛替尼耐藥性現(xiàn)象，但當(dāng)突變只出現(xiàn)在第19位外顯子時，耐藥性情況則可能出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)[32]?；诖爽F(xiàn)象，靶向T790M突變出現(xiàn)了所謂第三代治療EGFR-TKIs耐藥性藥物AZD9291，它是一種單苯胺基嘧啶復(fù)合物，已經(jīng)在臨床上被證實(shí)可以逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs耐藥性，對于具有EGFR突變耐藥性的NSCLC患者具有良好效果[33]。EGFR和AKT蛋白均是Hsp90的靶向蛋白，Hashida S等發(fā)現(xiàn)[34]，采用Hsp90抑制劑NVP-AUY922可以通過改變TKIs獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞周期，抑制EGFR突變的NSCLC細(xì)胞生長，對EGFR-TKIs出現(xiàn)的獲得性耐藥具有很好的治療效果。

隨著表觀遺傳學(xué)發(fā)展，新的研究發(fā)現(xiàn)在CpG二核苷酸的胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine，5-mC)與EGFR-TKIs的耐藥性也有密切關(guān)系。Fujii A等研究發(fā)現(xiàn)[35]，在18例NSCLC腫瘤組織、7例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織以及4株NSCLC細(xì)胞的EGFR基因790位密碼子均出現(xiàn)了5-mC，說明CpG的二核苷酸的甲基化與EGR-TKI獲得性耐藥密切相關(guān)，可能是輔助治療NSCLC患者的一個潛在靶點(diǎn)。

2 MET基因表達(dá)與突變

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte，HGF)是酪氨酸激酶受體c-MET的配體，由此活化的HGF/c-MET信號通路是由HGF作用于c-MET，引起一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的酶促反應(yīng)，誘發(fā)一系列與細(xì)胞增殖、遷移和血管發(fā)生等一系列生物效應(yīng)。首次提出的MET原癌基因擴(kuò)增與EGFR-TKIs耐藥性有關(guān)是在構(gòu)造吉非替尼耐藥細(xì)胞株模型時發(fā)現(xiàn)的。病理研究發(fā)現(xiàn)，采用EGFR-TKIs治療EGFR突變的NSCLC患者，在出現(xiàn)耐藥性后對其腫瘤標(biāo)本進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，MET基因出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象，同時還發(fā)現(xiàn)腫瘤具有上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象出現(xiàn)，說明二者可能與NSCLC后期治療的耐藥性有關(guān)[36]。熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)中MET陽性肺腺癌患者較MET陰性患者具有較短的無進(jìn)展生存期與總生存率，單變量分析發(fā)現(xiàn)METFISH陽性結(jié)果與NSCLC患者的生存及預(yù)后具有密切關(guān)系。因此，通過分析MET基因狀態(tài)可用于確定EGFR-TKI治療情況[37]。

在EGFR-TKIs獲得性耐藥患者中，有超過13%的患者檢測到MET基因擴(kuò)增[38]，而且在部分NSCLC細(xì)胞株中也發(fā)現(xiàn)MET出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象[39]。尤其是初始對吉非替尼的敏感性肺癌細(xì)胞HCC827中，通過MET擴(kuò)增表現(xiàn)出了對吉非替尼的耐藥性[40]。MET等相關(guān)基因擴(kuò)增通常會對EGFR突變的獲得性耐藥患者產(chǎn)生影響，有研究發(fā)現(xiàn)對厄洛替尼和吉非替尼耐藥的肺腺癌患者中有超過21%的患者出現(xiàn)MET基因擴(kuò)增，而非EGFR-TKIs治療的患者中出現(xiàn)MET擴(kuò)增的概率僅為3%[38]。另有研究表明，EGFR出現(xiàn)T790M突變的患者中也有可能同時存在MET基因擴(kuò)增，表明在EGFR獲得性抗性患者中可以同時存在兩種基因突變[41]。MET擴(kuò)增發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)主要是通過使ERBB3蛋白發(fā)生磷酸化，繼而激活PI3K/AKT通路，將細(xì)胞生存信號向下游傳遞，并且即使在使用EGFR-TKIs時該通路依然可以發(fā)揮信號傳遞作用[42]。所以如果同時使用EGFR-TKIs與MET抑制劑可能會阻斷PI3K/AKT通路，利于EGFR-TKIs發(fā)揮抑制癌癥進(jìn)展，這可能是一個潛在的治療NSCLC患者獲得性耐藥的方向。

3 免疫及其他變化所致獲得性耐藥

人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了機(jī)體免疫變化與多種疾病有關(guān)，于是有研究者構(gòu)建了EGFR-TKIs獲得性耐藥的H1650GR(吉非替尼耐藥性)細(xì)胞，通過RNA序列分析及單核苷酸多態(tài)性陣列分析發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞中與細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的改變[43]。程序性死亡分子1及其配體(programmed death-1/ligand，PD-1/PD-L1)是一對負(fù)性免疫共刺激分子，具有抑制淋巴細(xì)胞功能和誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡，在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病等作用。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)PD-L1，可與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面的PD-1分子結(jié)合，抑制淋巴細(xì)胞的功能及細(xì)胞因子的釋放，并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，從而抵抗淋巴細(xì)胞的殺傷作用，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸。Lin等[44]利用免疫組化技術(shù)檢測了56例患者腫瘤樣本的PD-L1、PD-1的表達(dá)情況，其中二者的陽性率分別為53.6%和32.1%。其中PD-L1陽性患者在經(jīng)過EGFR-TKI治療后，在無進(jìn)展生存期時間、總生存期等方面均優(yōu)于PD-L1陰性患者，但在PD-1患者中則觀察不到類似情況，可以推測EGFR突變陽性的NSCLC患者適用于PD-1/PDl-1的免疫治療，PD-L1可能為輔助EGFR-TKIs治療NSCLC患者的潛在生物靶標(biāo)。XAGE1(GAGED2a)是一種癌癥抗原，有超過40%的肺腺癌患者出現(xiàn)其表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)[45]，在EGFR突變患者體中，如果具有XAGE1(GAGED2a)的抗體，則總生存期會優(yōu)于無XAGE1(GAGED2a)抗體的患者，提示可通過設(shè)計(jì)針對XAGE1(GAGED2a)抗原的特異性抗體的方式，采用免疫治療EGFR突變的NSCLC患者。免疫研究發(fā)現(xiàn)針對EGFR的T790M突變存在新的限制性T細(xì)胞抗原表位，包括發(fā)生甲硫氨酸殘基突變的T790M、T790M-5、T790M-7等均可能是治療EGFR-TKI耐藥性患者的潛在靶點(diǎn)[46]。以上研究表明，在臨床治療EGFR-TKIs耐藥性的NSCLC患者的同時，采用免疫抑制劑等免疫治療手段，輔助或者直接用于臨床治療將是一個很有前景的研究方向。

獲得性耐藥方面，除了T790M突變與MET基因擴(kuò)增外，新的獲得性耐藥的誘因仍然處于積極探索中。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA GAS5在EGFRTKIS耐藥性細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于EGFR-TKIs敏感性細(xì)胞，并且GAS5過表達(dá)與EGFR通路的激活以及胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，表明GAS5可能是治療EGFR-TKIs獲得性耐藥的一個潛在靶點(diǎn)[47]。

綜上所述，目前采用EGFR-TKIs靶向治療NSCLC患者仍然屬于較為有效的治療手段，可以使患者免受傳統(tǒng)化療手段所帶來的痛苦。但在初期對EGFR-TKIs敏感性階段的治療后，耐藥性問題的出現(xiàn)困擾了NSCLC患者的繼續(xù)治療。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，與耐藥性有關(guān)的基因不斷被挖掘，包括當(dāng)前研究熱點(diǎn)-長鏈非編碼RNA也與EGFR-TKIs的耐藥有關(guān)。由于研究發(fā)現(xiàn)眾多基因、蛋白和信號通路等均參與同一種或者多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，所以盡可能的發(fā)現(xiàn)與EGFR-TKIs耐藥有關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物將有利于尋找靶向治療NSCLC患者EGFRTKIs耐藥性的治療策略，阻斷治療過程中出現(xiàn)的耐藥，而為治療NSCLC患者帶來新的機(jī)遇。

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