何重遠(yuǎn) 劉百薇 柏琪 陶霖 佡劍非 鄭東明

載脂蛋白E基因多態(tài)性與遺忘型認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性研究

何重遠(yuǎn) 劉百薇 柏琪 陶霖 佡劍非 鄭東明

目的 探討載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因多態(tài)性與遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙(amnestic mild cognitive impairment,aMCI)的相關(guān)性。 方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)并分析比較63例aMCI患者和60例年齡匹配的認(rèn)知功能正常老年人的ApoE基因多態(tài)性。 結(jié)果 aMCI組ApoE基因型中ε3/4型的頻率(28.6%)顯著高于正常老年組(13.3%),其他基因型頻率2組間無(wú)明顯差異。aMCI組ApoEε4的等位基因頻率(25%)顯著高于正常老年組(11.5%),ε2和ε3的等位基因頻率尚無(wú)顯著性差異。 結(jié)論 aMCI患者有較高的ApoE ε4基因攜帶率,對(duì)這一指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),可以對(duì)該類(lèi)患者進(jìn)行全面客觀的評(píng)價(jià)。

載脂蛋白E; 輕度認(rèn)知功能障礙; 基因多態(tài)性

輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment,MCI)是介于正常老化和癡呆之間的中間狀態(tài),其中以記憶力障礙為主要表現(xiàn)的遺忘型認(rèn)知功能障礙(amnestic MCI,aMCI)被認(rèn)為是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的前驅(qū)狀態(tài),以每年10%～16.5%的比例進(jìn)展為AD。已經(jīng)有大量的研究表明載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)等位基因ε4是與散發(fā)AD最為相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因[1]。本研究對(duì)aMCI患者的ApoE基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)及分析, 并與健康老年人群進(jìn)行對(duì)照, 以探討ApoE基因與aMCI的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在本院體檢中心、神經(jīng)內(nèi)科記憶力障礙門(mén)診招募符合研究條件的老年志愿者。aMCI組入組標(biāo)準(zhǔn):(1)有記憶力減退的主訴;(2)臨床癡呆評(píng)定量表(clinical dementia rating,CDR)評(píng)分為0.5分,蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(MoCA)評(píng)分<26分,聽(tīng)覺(jué)詞語(yǔ)學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn)的延遲回憶低于正常參考值1.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上;(3)簡(jiǎn)易精神狀況檢查量表(MMSE)、日常生活能力量表(ADL)、焦慮抑郁自評(píng)量表評(píng)分在正常范圍;(4)沒(méi)有明確的心腦血管、神經(jīng)、精神類(lèi)疾病病史,無(wú)酗酒及藥物濫用史,常規(guī)體檢化驗(yàn)排除高血壓、糖尿病、甲狀腺功能異常、維生素B12缺乏;(5)磁共振常規(guī)序列掃描沒(méi)有明顯的腦白質(zhì)疏松、腦梗死等影像學(xué)改變;(6)子女和本人同意參與該項(xiàng)研究并簽署知情同意書(shū)。最終共納入研究aMCI組63例,男27例,女36例,年齡60～77歲,平均(69.0±5.1)歲,教育程度(10.5±3.2)年。

對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn):(1)CDR評(píng)分0分;(2)MMSE、ADL、焦慮抑郁自評(píng)量表、MoCA評(píng)分在正常范圍;(3)滿(mǎn)足aMCI入組標(biāo)準(zhǔn)第4～6項(xiàng)之要求。對(duì)照組60例,男26例,女34例,年齡60～77歲,平均(69.4±4.6)歲,教育程度(11.1±3.4)年。

2組間年齡、性別、教育程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本研究得到中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 ApoE基因多態(tài)性檢測(cè) 抽取肘靜脈血2 ml,置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管內(nèi),分離白細(xì)胞用于檢測(cè)ApoE基因型。DNA的抽提采用酚/氯仿法, 適量雙蒸水溶解后作為PCR模板。

利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)ApoE特異性擴(kuò)張引物,上游引物(ApoE-F)為5′-GCCCCGTTCCTTCTCTCCCTCTT-3′,下游引物(ApoE-R)為5′-CCGGCTGCCCATCTCCTCCATC-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為647 bp,交由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系包括:2×Pcr Mix 12.5 μl(Promega),上下游引物各1 μl(10 μMmol/L),DNA模板1 μl(30～60 ng/μl),加雙蒸水至總體積25 μl。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。測(cè)序分析使用PCR產(chǎn)物測(cè)序法,利用ABI 3730XL測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司),ApoE-F為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序,采用Chromas軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

ApoE基因有ε2、ε3和ε4 3種等位基因,相應(yīng)的ApoE基因型有3種純合型(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和3種雜合型(ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4)。依據(jù)位于112位和158位的2個(gè)氨基酸殘基種類(lèi)來(lái)確定對(duì)應(yīng)的等位基因:ε2(112Cys/158Cys)、ε3(112Cys/158Arg)、ε4(112Arg/158Arg)。

1.3 基因型和等位基因頻率計(jì)算方法 基因型頻率=基因型頻數(shù)/總例數(shù); 等位基因頻率采用平衡法:ε2=ε2/2+1/2 (ε2/3+ε2/4); ε3=ε3/3+1/2 (ε2/3+ε3/4); ε4=ε4/4+1/2 (ε3/4+ε2/4)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),全部結(jié)果均采用SPSS 10.0軟件處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ApoE基因型頻率 2組ApoE基因型分布都以ε3/3型多見(jiàn),在健康對(duì)照組為65%,在aMCI組為50.8%,2組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。aMCI組ε3/4的基因型頻率(28.6%)顯著高于對(duì)照組(13.3%)(P=0.04),ε4/4、ε3/2、ε2/4的基因型頻率2組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,詳見(jiàn)表1。2組均未檢測(cè)到ε2/2基因型。

表1 2組ApoE基因型頻率(n,%)

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05

2.2 ApoE等位基因頻率 aMCI組ε4等位基因頻率為25%,顯著高于對(duì)照組的11.5%(P<0.05),ε2、ε3的等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 2組ApoE等位基因頻率(%)

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05

3 討論

Strittmatter等[2]于1993年首先報(bào)道了ApoE ε4等位基因是AD的高危因素和易患基因,攜帶一個(gè)ε4等位基因可以使其患遲發(fā)AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2～3倍,攜帶2個(gè)ε4等位基因可以使其患遲發(fā)AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加>8倍。此后,國(guó)外大量的流行病學(xué)研究不斷證實(shí)ApoE ε4基因型是AD發(fā)病的易感基因和獨(dú)立危險(xiǎn)因素,這一結(jié)論已經(jīng)得到多個(gè)癡呆診療指南的確認(rèn)[1, 3]。國(guó)內(nèi)針對(duì)這一問(wèn)題的大樣本流行病學(xué)研究雖然不多,但一項(xiàng)基于國(guó)內(nèi)1990～2010年各研究數(shù)據(jù)的Meta分析也顯示等位基因ApoE ε4是中國(guó)人群AD的危險(xiǎn)基因(OR=3.53,95%CI:2.49～5.00)[4]。

由于aMCI與AD關(guān)系密切,近年來(lái)國(guó)外已經(jīng)有些研究著眼于aMCI患者的ApoE的基因型分布特點(diǎn),但是結(jié)論不一。許多研究提示ApoE ε4等位基因與aMCI密切相關(guān)[5-6],但也有部分研究并未發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)性,如Heun等[7]基于社區(qū)人群的觀察并未發(fā)現(xiàn)ApoE ε4基因與aMCI的發(fā)病相關(guān)。國(guó)內(nèi)針對(duì)這一問(wèn)題的研究很少,所采用的aMCI的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也過(guò)于簡(jiǎn)單[8],影響結(jié)論的可信度。我們的研究顯示aMCI患者的ε3/4基因型頻率顯著高于正常對(duì)照組,ε4等位基因頻率顯著高于正常對(duì)照組,與大多數(shù)國(guó)外研究結(jié)論相似[5-6]。一些研究發(fā)現(xiàn)，ε2和ε3等位基因可能是AD和MCI的保護(hù)性因素[2，4],我們的研究并未發(fā)現(xiàn)ε2、ε3等位基因頻率在2組間有明顯的差異,這一問(wèn)題還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行觀察。

目前已經(jīng)有大量研究試圖從分子生物學(xué)水平闡述ApoE基因多態(tài)性影響AD的病理生理過(guò)程。目前研究結(jié)果顯示AD的主要病理變化,如神經(jīng)炎性斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、腦淀粉樣血管病變均受到ApoE基因多態(tài)性的影響,其中ApoE ε4往往與上述病理改變更加嚴(yán)重有關(guān)。與其他表型相比,ApoE ε4可導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ清除率下降和Aβ沉積增加、微管蛋白穩(wěn)定性下降、突觸功能障礙、更重的炎性反應(yīng)和更差的神經(jīng)修復(fù)能力[9-10]。這方面的研究雖然很多,但還沒(méi)能從根本上闡明ApoE基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理生理過(guò)程中發(fā)揮怎樣的作用,值得進(jìn)一步深入研究。

本研究采用的是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法,該技術(shù)成熟穩(wěn)定,測(cè)試價(jià)格也比以前大幅下降,適合臨床開(kāi)展。需要強(qiáng)調(diào)的是ApoE ε4基因型僅僅是AD的危險(xiǎn)因素之一,而并非是AD發(fā)病的決定性因素,因此ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)并不能用于AD和aMCI的臨床診斷, 更不能代替臨床、神經(jīng)心理及神經(jīng)影像等檢查。但是,目前針對(duì)AD和MCI患者進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)還是有一定的臨床實(shí)際意義,主要表現(xiàn)為以下方面:首先由于對(duì)aMCI患者是否需要給予抗癡呆藥物治療尚有爭(zhēng)議[11],而一些研究提示攜帶ApoE ε4基因的aMCI患者更容易進(jìn)展為AD[12-13],因此在治療指南更改之前,可以對(duì)攜帶ApoE ε4基因的aMCI患者進(jìn)行比較積極的抗癡呆藥物干預(yù);其次,盡管仍有爭(zhēng)議,一些研究提示攜帶ApoE ε4基因的aMCI、AD患者對(duì)膽堿酯酶抑制劑的反應(yīng)要優(yōu)于非攜帶者[14-16],所以對(duì)攜帶者的治療可以以膽堿酯酶抑制劑為主,而對(duì)非攜帶者如果膽堿酯酶抑制劑療效不佳的話可盡早考慮更換或者合并使用其他種類(lèi)藥物如鹽酸美金剛。此外,ApoE ε4與AD和aMCI的密切關(guān)系也為AD治療提供了新思路,如可以抑制ApoE ε4基因表達(dá)的他汀類(lèi)藥物是否能對(duì)AD有治療作用一直是近幾年研究的熱點(diǎn)[17]。

綜上所述,本研究顯示aMCI患者有著較高的ApoE ε4基因攜帶率,與國(guó)外流調(diào)結(jié)論類(lèi)似。臨床上可以開(kāi)展針對(duì)認(rèn)知功能障礙患者的ApoE基因多態(tài)性檢測(cè),在結(jié)合臨床、神經(jīng)心理及神經(jīng)影像等其他檢查基礎(chǔ)上, 可以為AD和aMCI診斷及干預(yù)方案提供更多的臨床決策依據(jù)。

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Association between genetic polymorphisms of apolipoprotein E and amnestic mild cognitive impairment

HEZhong-yuan.ClinicalLaboratory;LIUBai-wei,BAIQi,TAOLin,NAOJian-fei,ZHENGDong-ming.

DepartmentofNeurology,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China

Objective To investigate the relationship between genetic polymorphisms of apolipoprotein E (ApoE) and amnestic mild cognitive impairment (aMCI). Methods Direct PCR sequencing was used to analyze the genetic polymorphisms of ApoE in 63 patients with aMCI and 60 age-matched old people with normal cognitve functions. Results The frequency of ApoE ε3/4 genotype was 28.6% in the aMCI group, which was significantly higer than that in the control group (13.3%). There were no differences in the frequencies of other genotypes of ApoE between the two groups. The frequency of allele ε4 in the aMCI group (25%) was significantly higher than that in the control group (11.5%). No difference in the frequency of allele ε2 and ε3 was found between the two groups. Conclusions Higher allele frequency of ApoE ε4 is associated with aMCI. The detection of polymorphism of ApoE might be beneficial for a thorough evaluation of aMCI.

apolipoprotein E; mild cognitive impairment; gene polymorphism

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000467)

110004遼寧省沈陽(yáng)市，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心(何重遠(yuǎn))；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(劉百薇，柏琪，陶霖，佡劍非,鄭東明)

鄭東明，Email: zhengdm@sj-hospital.org

R 749.16

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.02.007

2014-04-25)