郭曉強(qiáng)

石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，石家莊 050081

酶的研究與生命科學(xué)(三)：分子生物學(xué)酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用

郭曉強(qiáng)?

石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，石家莊 050081

20世紀(jì)下半葉，分子生物學(xué)取得迅猛發(fā)展，分子生物學(xué)酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用在其中發(fā)揮了巨大的推動(dòng)作用。DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶和端粒酶等的鑒定和功能闡明拓展了對(duì)許多生命現(xiàn)象的理解和認(rèn)識(shí)。這些酶的應(yīng)用還衍生出重組DNA、桑格酶法測(cè)序和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)，在基因操作、DNA測(cè)序和擴(kuò)增等方面具有廣泛應(yīng)用。通過(guò)介紹分子生物學(xué)酶的研究歷程展現(xiàn)了酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)當(dāng)代生命科學(xué)研究仍有重要意義。

分子生物學(xué)酶；DNA聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶；限制性內(nèi)切酶；分子生物學(xué)技術(shù)；諾貝爾獎(jiǎng)

繁殖是生命的另一個(gè)典型特征，而繁殖的基礎(chǔ)在于遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定傳遞。孟德?tīng)柾愣闺s交實(shí)驗(yàn)開(kāi)啟了遺傳學(xué)時(shí)代，到20世紀(jì)中葉遺傳學(xué)研究開(kāi)始進(jìn)入分子水平。1953年，沃森和克里克的DNA雙螺旋模型的提出標(biāo)志著分子生物學(xué)的誕生。60多年來(lái)，分子生物學(xué)領(lǐng)域取得了一系列重大的成果，極大地拓展了人們對(duì)生命現(xiàn)象的理解和認(rèn)識(shí)，相關(guān)知識(shí)的應(yīng)用也對(duì)改善人們的生活質(zhì)量產(chǎn)生了積極影響。分子生物學(xué)研究的中心內(nèi)容是DNA、RNA及蛋白質(zhì)的信息傳遞和相互作用，而酶在其中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。從20世紀(jì)50年代開(kāi)始先后鑒定出DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA連接酶、引物酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶和端粒酶等，這些酶的研究和應(yīng)用還推動(dòng)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，誕生了基因重組技術(shù)、DNA酶法測(cè)序和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室常用方法。本文通過(guò)介紹分子生物學(xué)酶的研究歷程從另一方面展現(xiàn)分子生物學(xué)的發(fā)展軌跡。

1 多核苷酸磷酸酶的發(fā)現(xiàn)

1953年后，DNA和RNA這兩類生物大分子的重要性開(kāi)始引起科學(xué)界的關(guān)注，生物化學(xué)研究領(lǐng)域也逐漸從物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)移到分子生物學(xué)。不久西班牙裔美國(guó)生物化學(xué)家?jiàn)W喬亞(Severo Ochoa)就率先取得重大突破，鑒定出多核苷酸磷酸酶。

奧喬亞在西班牙馬德里大學(xué)醫(yī)學(xué)院獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，早期主要研究肌肉生理學(xué)和生物化學(xué)，闡明了糖酵解的多步酶促反應(yīng)。1941年，奧喬亞來(lái)到美國(guó)，先后在華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院和紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院工作，期間主要對(duì)物質(zhì)代謝特別是三羧酸循環(huán)的闡明發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。他的實(shí)驗(yàn)室掌握了酶的鑒定、純化和分析等技術(shù)，奧喬亞本人也成為酶學(xué)領(lǐng)域的核心人物之一。DNA和RNA作為遺傳物質(zhì)(RNA病毒)地位的確立使奧喬亞決定從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)向RNA合成研究。

1955年，奧喬亞的一名博士后在研究氧化磷酸化機(jī)制過(guò)程中，觀察到醋酸菌提取液中具有磷酸和ADP交換活性。隨后他將負(fù)責(zé)催化該反應(yīng)的酶進(jìn)行分離和純化，發(fā)現(xiàn)該酶可催化二核苷酸(NDP)合成類似RNA分子的多聚核苷酸。由于該酶與多糖合成酶催化功能類似，因此命名為多核苷酸磷酸酶(polynucleotide phosphorylase，PNPase)(圖1)[1]。一開(kāi)始，奧喬亞希望多核苷酸磷酸酶就是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)RNA生物合成(DNA轉(zhuǎn)錄或RNA復(fù)制)的酶，但隨后發(fā)現(xiàn)該酶發(fā)揮催化作用時(shí)不需DNA或RNA模板，這意味著該酶不符合預(yù)期目標(biāo)。但不久，奧喬亞發(fā)現(xiàn)該酶可用于特定多核苷酸鏈的合成和末端磷酸同位素標(biāo)記，而這些產(chǎn)物在體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)和遺傳密碼破譯等研究中具有廣泛應(yīng)用。借助多核苷酸磷酸酶合成的寡聚核苷酸，奧喬亞確定了蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中RNA方向?yàn)?′到3′，并破譯部分密碼子。多核苷酸磷酸酶是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的與RNA合成相關(guān)的酶，盡管并不負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄，卻激發(fā)了多名科學(xué)家的靈感以尋找更多核酸生成相關(guān)酶。不久奧喬亞的學(xué)生美國(guó)生物化學(xué)家阿瑟?科恩伯格(Arthur Kornberg)就發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶。

圖1 奧喬亞和多核苷酸磷酸酶

2 DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)

阿瑟?科恩伯格在紐約城市學(xué)院完成學(xué)業(yè)。1946年他來(lái)到紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院奧喬亞實(shí)驗(yàn)室接受了系統(tǒng)的酶學(xué)訓(xùn)練，隨后開(kāi)始對(duì)輔酶和無(wú)機(jī)焦磷酸酶合成機(jī)制進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)了核苷酸輔酶如FAD、NAD等的生物合成過(guò)程。1953年，科恩伯格加入華盛頓大學(xué)。隨著DNA重要性的凸顯，他將DNA代謝相關(guān)酶作為重要研究目標(biāo)，先后闡明嘌呤和嘧啶核苷酸合成途徑的關(guān)鍵步驟。對(duì)核苷酸的研究很自然就使科恩伯格想到這些核苷酸如何連接形成DNA，因?yàn)殡p螺旋模型盡管預(yù)示DNA具有自我復(fù)制能力，卻一直未有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

1955年春，科恩伯格以大腸桿菌提取液為材料，用放射性同位素標(biāo)記核苷酸的方法證明存在催化脫氧核苷酸多聚化酶。隨后科恩伯格決定和學(xué)生及同事將該酶純化，以進(jìn)一步闡明其生物學(xué)活性及催化特性。經(jīng)過(guò)一年多艱苦努力，科恩伯格等終于在1957年將該酶純化。在該酶的催化作用下以四種脫氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)為原料可以合成DNA，并且需要DNA作為模板(圖2)[2-3]。需要指出的是，科恩伯格使用該酶首次在試管中合成DNA，這是生命科學(xué)史上的一個(gè)重大進(jìn)步，說(shuō)明DNA可在DNA聚合酶催化下合成新DNA鏈，即DNA復(fù)制，而DNA復(fù)制是物種遺傳信息傳遞的基礎(chǔ)。

圖2 科恩伯格和DNA聚合酶

1959年，奧喬亞和科恩伯格由于“發(fā)現(xiàn)RNA和DNA的生物合成機(jī)理”而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。值得一提的是，奧喬亞的獲獎(jiǎng)是一個(gè)“錯(cuò)誤”，因此阿瑟?科恩伯格在后來(lái)一篇回憶文章中認(rèn)為頒獎(jiǎng)詞應(yīng)糾正為“發(fā)現(xiàn)RNA樣聚合物和DNA的生物合成機(jī)理”更為符合[4]。由于多核苷酸磷酸酶在遺傳密碼破譯中的重要性，奧喬亞獲獎(jiǎng)也算實(shí)至名歸。其實(shí)，阿瑟?科恩伯格的發(fā)現(xiàn)后來(lái)證明也存在一定問(wèn)題。他發(fā)現(xiàn)的酶被命名為DNA聚合酶Ⅰ，但該酶并非負(fù)責(zé)細(xì)菌內(nèi)DNA復(fù)制，而主要參與DNA損傷修復(fù)。真正發(fā)揮DNA復(fù)制的酶為DNA聚合酶Ⅲ，該酶由阿瑟二兒子托馬斯(Thomas Bill Kornberg)于1972年鑒定成功，也算“自我”彌補(bǔ)。

諾貝爾獎(jiǎng)出現(xiàn)“失誤”的一個(gè)重要原因在于DNA和RNA生物合成在當(dāng)時(shí)的重要性。奧喬亞的發(fā)現(xiàn)間隔4年，而阿瑟的發(fā)現(xiàn)只有1年多時(shí)間，充分體現(xiàn)了科學(xué)界對(duì)這兩項(xiàng)工作的高度認(rèn)可(DNA雙螺旋模型的獲獎(jiǎng)還等了9年)，同時(shí)也說(shuō)明酶的重要性。DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)意義重大，一方面初步闡明DNA的復(fù)制機(jī)制，深化對(duì)生命過(guò)程的理解和認(rèn)識(shí)，另一方面還為分子生物學(xué)提供重要工具。DNA聚合酶在多種技術(shù)如DNA重組、DNA測(cè)序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等都具有廣泛應(yīng)用。

3 RNA聚合酶結(jié)構(gòu)的闡明

真正催化細(xì)菌DNA轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶于1959年由美國(guó)生物化學(xué)家赫爾維茨(Jerard Hurwitz)等發(fā)現(xiàn)。10年后美國(guó)生物學(xué)家盧德(Robert Roeder)進(jìn)一步鑒定出三種真核RNA聚合酶，它們分別負(fù)責(zé)不同RNA(rRNA、mRNA和tRNA等)前體分子的轉(zhuǎn)錄，從而全面開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄機(jī)制的研究。20世紀(jì)70和80年代，科學(xué)家還先后鑒定出多種通用轉(zhuǎn)錄因子和特異性轉(zhuǎn)錄因子，它們和RNA聚合酶共同參與轉(zhuǎn)錄完成，但轉(zhuǎn)錄的詳細(xì)分子機(jī)制則由美國(guó)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家羅杰?科恩伯格(Roger David Kornberg)闡明。

羅杰是阿瑟的大兒子，在哈佛大學(xué)獲得化學(xué)學(xué)士學(xué)位，后進(jìn)入斯坦福大學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。20世紀(jì)70年代，羅杰來(lái)到當(dāng)時(shí)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的“圣地”——英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)MRC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行博士后研究，并于1974年發(fā)現(xiàn)核小體結(jié)構(gòu)。

1978年，羅杰加入斯坦福大學(xué)，開(kāi)始了對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄的機(jī)理研究。為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，羅杰放棄使用小鼠和其他哺乳動(dòng)物為研究材料，而是選擇較簡(jiǎn)單的酵母。三種RNA中，編碼蛋白質(zhì)的mRNA種類最為多樣，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)也最為精細(xì)，因此羅杰將RNA聚合酶Ⅱ作為研究對(duì)象。羅杰首先成功制備出酵母體外轉(zhuǎn)錄體系，從中發(fā)現(xiàn)參與mRNA轉(zhuǎn)錄的第三大類元件——中介體(mediator)，它們與RNA聚合酶Ⅱ和轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成轉(zhuǎn)錄器。

20世紀(jì)90年代，在了解真核生物轉(zhuǎn)錄基本元件及功能基礎(chǔ)上，羅杰決定確定基本元件間相互作用及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，這需要借助結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)。真核轉(zhuǎn)錄復(fù)合物由多亞基構(gòu)成，以較簡(jiǎn)單的酵母為例，其RNA聚合酶有12個(gè)亞基，轉(zhuǎn)錄因子26個(gè)亞基，而中介體21個(gè)亞基，因此形成一個(gè)擁有近60個(gè)亞基、分子量超過(guò)3 000 kD的大轉(zhuǎn)錄器(圖3)。此外，研究面臨的難題還包括多蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性差，而經(jīng)典的結(jié)構(gòu)研究方法重點(diǎn)在靜態(tài)結(jié)構(gòu)，因此對(duì)轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)變化的研究貢獻(xiàn)有限。在隨后十幾年中，多個(gè)研究小組都投入巨大精力，但進(jìn)展緩慢。羅杰憑借X射線晶體衍射方面熟練的技巧和研究過(guò)程中的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了將電子衍射技術(shù)和脂質(zhì)層技術(shù)相結(jié)合的方法，從而獲得二維蛋白晶體等。

圖3 羅杰和RNA聚合酶

2001年，羅杰的研究取得重大突破，第一次在分子水平上闡明了轉(zhuǎn)錄機(jī)制。羅杰獲得酵母RNA聚合酶Ⅱ在2.8A°分辨率上的結(jié)構(gòu)[5]，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶Ⅱ的兩個(gè)最大亞基位于DNA結(jié)合部位兩側(cè)，而其他小亞基則位于外圍。隨后幾年，羅杰又相繼獲得許多轉(zhuǎn)錄過(guò)程復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，從而對(duì)轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶Ⅱ、模板DNA、新形成RNA、四種核苷酸及轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的位置和作用方式等有了一個(gè)清晰、動(dòng)態(tài)的理解，對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的移位、鏈分離、核苷酸選擇、啟動(dòng)子識(shí)別等過(guò)程也有了更深一步的認(rèn)識(shí)。由于RNA聚合酶及相關(guān)亞基在酵母和高等哺乳動(dòng)物(包括人)中的高度保守性，這些研究將對(duì)理解人類基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制具有重要益處。

2006年，羅杰由于“真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分子基礎(chǔ)方面的研究”而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，其精細(xì)調(diào)節(jié)對(duì)保證機(jī)體正常狀態(tài)具有十分重要的意義，如干細(xì)胞的增殖和分化，器官的發(fā)育和形成等?；蜣D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異?？蓪?dǎo)致腫瘤、炎癥和代謝性疾病等的發(fā)生。因此，對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程精細(xì)機(jī)制的理解具有重大的理論和應(yīng)用價(jià)值。

4 逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)

美國(guó)生物化學(xué)家特明(Howard Martin Temin)小時(shí)候就對(duì)科學(xué)表現(xiàn)出極大興趣，在賓夕法尼亞的斯沃斯茅學(xué)院完成生物學(xué)教育后進(jìn)入加州理工學(xué)院進(jìn)行博士研究，跟隨意大利裔美國(guó)科學(xué)家杜爾貝科(Renato Dulbecco)探索病毒的致癌機(jī)制。杜爾貝科研究可引發(fā)小鼠腫瘤的多瘤病毒(DNA病毒)，發(fā)現(xiàn)病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后可插入宿主DNA，從而作為整體一起復(fù)制，宿主由于獲得病毒基因而出現(xiàn)癌變。然而，特明選擇的是勞斯肉瘤病毒，這是一種RNA病毒，它如何誘導(dǎo)細(xì)胞癌變成為需要解決的難題。在研究中特明發(fā)現(xiàn)，盡管勞斯肉瘤病毒遺傳物質(zhì)是RNA，但抑制DNA復(fù)制也影響病毒復(fù)制；因此特明于1965年根據(jù)杜爾貝科理論提出解釋勞斯肉瘤病毒致癌機(jī)制：RNA病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，首先將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，生成的DNA再與宿主細(xì)胞DNA整合，隨宿主一起復(fù)制和遺傳。

特明理論很好地解釋了RNA病毒的致癌機(jī)制，卻遭到許多科學(xué)家的反對(duì)。按照1958年克里克描述信息傳遞的“中心法則”，遺傳信息一般從DNA傳遞給RNA，而不逆行。而且特明理論中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是RNA如何將信息傳遞給DNA尚未用實(shí)驗(yàn)證實(shí)。隨后幾年中，特明和同事以勞斯肉瘤病毒為材料尋找具有催化RNA到DNA的酶。

1970年，特明鑒定出以RNA為模板的DNA聚合酶[6]，由于該酶催化的反應(yīng)與轉(zhuǎn)錄過(guò)程(以DNA為模版合成RNA)正好相反，因此將該酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶。與此同時(shí)，特明的校友美國(guó)科學(xué)家巴爾的摩(David Baltimore)也鑒定出逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)一步證實(shí)了特明的發(fā)現(xiàn)。

巴爾的摩也畢業(yè)于斯沃斯茅學(xué)院，接受了較系統(tǒng)的分子生物學(xué)培訓(xùn)。1964年巴爾的摩從麻省理工學(xué)院獲得生物物理博士學(xué)位，之后不久獲悉特明提出的RNA病毒致癌假說(shuō)。盡管大多數(shù)科學(xué)家都持懷疑態(tài)度，但巴爾蒂摩敏銳地察覺(jué)到該理論的重要性，并認(rèn)為自然界一定存在該過(guò)程，因此決定將研究方向轉(zhuǎn)向病毒領(lǐng)域。

圖4 特明、巴爾的摩與逆轉(zhuǎn)錄酶

1965年，巴爾的摩進(jìn)入索爾克研究所與杜爾貝科合作研究病毒學(xué)，不久從脊髓灰質(zhì)炎病毒(RNA病毒)鑒定出一種RNA聚合酶，但隨后結(jié)果令巴爾的摩失望。該酶是以RNA為模板，因此并不符合特明假說(shuō)。1968年，巴爾的摩回到麻省理工學(xué)院，繼續(xù)進(jìn)行病毒的研究。功夫不負(fù)有心人！1970年，巴爾的摩憑借酶學(xué)研究嫻熟的技術(shù)最終從可誘發(fā)癌變的鼠白血病病毒中鑒定出RNA依賴的DNA聚合酶[7]。逆轉(zhuǎn)錄酶可首先以RNA為模板合成出互補(bǔ)DNA(cDNA)，隨后將模板RNA降解，接下來(lái)再以cDNA為模板合成另一條DNA鏈而生成雙鏈DNA(圖4)，雙鏈DNA可整合到宿主DNA而實(shí)現(xiàn)致癌。

1975年，特明和巴爾的摩以及杜爾貝科由于“腫瘤病毒和細(xì)胞遺傳材料間相互作用的發(fā)現(xiàn)”而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)初頒獎(jiǎng)重點(diǎn)在于病毒的致癌機(jī)制，然而令大家意想不到的是隨后的發(fā)現(xiàn)證明逆轉(zhuǎn)錄酶更為重要。逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)最重要的發(fā)現(xiàn)之一，它促使克里克1970年修改中心法則，還推動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，如導(dǎo)致艾滋病的HIV的發(fā)現(xiàn)等。另外，逆轉(zhuǎn)錄酶還成為分子生物學(xué)研究必不可少的基本工具，如DNA探針制備，基因工程中使用mRNA制備cDNA等。

至此，中心法則相關(guān)的三種酶——復(fù)制需要的DNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄需要的RNA聚合酶以及逆轉(zhuǎn)錄涉及的逆轉(zhuǎn)錄酶都被授予諾貝爾獎(jiǎng)。此外，分子生物學(xué)技術(shù)相關(guān)酶類也被鑒定成功。

5 限制性內(nèi)切酶的提出、分離和應(yīng)用

瑞士科學(xué)家阿爾伯(Werner Arber)在蘇黎士聯(lián)邦理工學(xué)院獲得學(xué)士學(xué)位，隨后在日內(nèi)瓦大學(xué)完成生物物理學(xué)博士學(xué)習(xí)，師從著名的生物物理學(xué)家威格爾(Jean-Jacques Weigle)研究噬菌體。20世紀(jì)50年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一種λ噬菌體對(duì)不同的大腸桿菌菌株具有不同的感染能力，如極易感染大腸桿菌C菌株的λ噬菌體對(duì)K菌株的感染力只是C菌株的千分之一，因此將大腸桿菌K菌株限制λ噬菌體感染的能力稱為“宿主控制的噬菌體限制”。這種現(xiàn)象引起阿爾伯極大的興趣。

1960年，阿爾伯加入日內(nèi)瓦大學(xué)，著手全面研究噬菌體限制的分子基礎(chǔ)。1962年，阿爾伯和研究生發(fā)現(xiàn)感染λ噬菌體并形成溶源狀態(tài)的大腸桿菌K12(K12-λ)對(duì)野生型λ噬菌體再次感染具有抵抗作用，但對(duì)溶菌后釋放的λ噬菌體(λ-P1)無(wú)抵抗作用，考慮到兩種噬菌體DNA序列一致，因此可能變化在于DNA結(jié)構(gòu)方面(圖5)。根據(jù)這種現(xiàn)象，阿爾伯推測(cè)宿主細(xì)胞中存在一種核酸內(nèi)切酶，可將侵染的噬菌體DNA切割成特定片段，從而實(shí)現(xiàn)限制作用；同時(shí)宿主細(xì)胞還存在DNA甲基化酶，以對(duì)自身DNA(包括溶源化后整合的λ噬菌體DNA)修飾以避免核酸內(nèi)切酶的切割[8-9]。盡管阿爾伯還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這樣的酶，但推測(cè)該內(nèi)切酶具有識(shí)別特定核苷酸序列的能力，并在特定位置實(shí)現(xiàn)DNA切割。阿爾伯將這種雙酶理論稱為限制-修飾系統(tǒng)，這種理論不久就得到證實(shí)。1965年，阿爾伯發(fā)現(xiàn)噬菌體特定核苷酸序列的突變可造成其對(duì)限制系統(tǒng)不敏感，而宿主細(xì)胞感染噬菌體后確實(shí)存在DNA甲基化修飾。1968年，阿爾伯從大腸桿菌中鑒定出一種內(nèi)切酶EcoB，另一小組獲得EcoK。這兩種酶都可識(shí)別特定核苷酸序列，但在隨機(jī)位置對(duì)DNA切割不具特異性，因此并非阿爾伯推測(cè)的酶。后來(lái)將其稱為Ⅰ型限制性內(nèi)切酶。1970年，具有識(shí)別和切割雙重特異性的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶被曾經(jīng)與阿爾伯一起工作過(guò)的美國(guó)微生物遺傳學(xué)家史密斯(Hamilton Othanel Smith)發(fā)現(xiàn)。

史密斯從加州大學(xué)伯克利分校獲得生物學(xué)學(xué)士學(xué)位，后又從約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院獲得醫(yī)學(xué)學(xué)位，但最終未成為一名醫(yī)生，而成為了一名科學(xué)家。史密斯很早就對(duì)細(xì)菌遺傳學(xué)情有獨(dú)鐘，然而在研究細(xì)菌遺傳重組時(shí)卻無(wú)法獲得噬菌體DNA，這個(gè)現(xiàn)象使他聯(lián)想到限制現(xiàn)象。1966年，史密斯來(lái)到瑞士日內(nèi)瓦阿爾伯的實(shí)驗(yàn)室，更加熟悉了阿爾伯限制-修飾假說(shuō)，同時(shí)對(duì)限制酶有了初步認(rèn)識(shí)。

回到美國(guó)后，史密斯全身心投入限制酶的分離工作。1970年，史密斯和同事經(jīng)過(guò)艱苦努力后終于從嗜血流感細(xì)菌(Haemophilus influenzae)中分離得到一種內(nèi)切酶。該酶可特異性識(shí)別雙鏈而不是單鏈DNA，并且只對(duì)噬菌體(外源)DNA具有切割作用，而對(duì)細(xì)菌DNA無(wú)任何影響。該酶對(duì)雙鏈DNA的切割不產(chǎn)生游離核苷酸，因此具有核酸內(nèi)切酶活性。由于所獲得酶切片段較大，因此切割具有位點(diǎn)特異性(圖5)[10]，這正符合阿爾伯所預(yù)測(cè)的限制性內(nèi)切酶。史密斯和同事還鑒定了該酶的識(shí)別及切割序列(5′GTT/C↓G/AAC 3′)，該酶被命名為HindII，這是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Ⅱ型限制性內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶的命名原則是前三個(gè)字母代表種屬名，第四個(gè)字母為株名，而最后數(shù)字表示鑒定的先后順序。如HindII就表示嗜血流感細(xì)菌(H和in)d株第二個(gè)酶。HindII的發(fā)現(xiàn)引起科學(xué)界極大關(guān)注，從而掀起一場(chǎng)尋找新型、可用的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶熱潮，而另一方面限制性內(nèi)切酶巨大的應(yīng)用潛力不久就被史密斯同事內(nèi)森斯(Daniel Nathans)發(fā)現(xiàn)并首先應(yīng)用。

內(nèi)森斯從特拉華大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，隨后又從華盛頓大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位。然而在工作中，他卻對(duì)基礎(chǔ)科學(xué)產(chǎn)生濃厚興趣，開(kāi)始病毒研究，主要是關(guān)于病毒與宿主的控制關(guān)系。20世紀(jì)60年代，科學(xué)家將病毒研究從細(xì)菌病毒(噬菌體)轉(zhuǎn)向哺乳動(dòng)物病毒，而內(nèi)森斯選擇猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)為材料研究其致癌機(jī)制，卻由于缺乏有效的實(shí)驗(yàn)手段而進(jìn)展緩慢。1969年春，身在以色列進(jìn)行研究的內(nèi)森斯接到同事史密斯的來(lái)信，告訴他發(fā)現(xiàn)了Ⅱ型限制性內(nèi)切酶HindII，該酶可在特定位置切割DNA。在獲悉限制性內(nèi)切酶鑒定成功后，內(nèi)森斯興奮異常，立刻意識(shí)到這些酶可像胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶作用于蛋白質(zhì)一樣實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的特異性剪切，從而將DNA消化為特定片段。對(duì)于SV40而言，通過(guò)限制性酶切而獲得小片段DNA，再通過(guò)對(duì)這些小片段DNA的定位和功能研究而確定病毒的致癌機(jī)制。

1969年秋，內(nèi)森斯回到約翰霍普金斯大學(xué)。首先，他用限制性內(nèi)切酶HindII對(duì)SV40的DNA進(jìn)行酶切，將產(chǎn)物進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記后用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，曝光結(jié)果顯示共獲得大小不同的11個(gè)片段(A到K，字母根據(jù)片段大小命名，其中A最長(zhǎng))[11]，并確定這些片段在SV40中的相應(yīng)位置(圖5)。隨后，內(nèi)森斯又應(yīng)用其他Ⅱ型限制性內(nèi)切酶對(duì)SV40進(jìn)行切割，一方面獲得了更清晰的限制性內(nèi)切酶圖譜，為深入理解基因結(jié)構(gòu)提供重要信息，另一方面通過(guò)分離研究小片段DNA而闡明相關(guān)基因的生物學(xué)功能。

圖5 阿爾伯、史密斯和內(nèi)森斯與限制性內(nèi)切酶

1978年，阿爾伯、史密斯和內(nèi)森斯由于在“限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其在分子遺傳學(xué)中的應(yīng)用”而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)(圖5)。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用開(kāi)啟了遺傳學(xué)研究的新紀(jì)元。限制性內(nèi)切酶為生命科學(xué)研究提供了重要工具，如DNA測(cè)序、基因工程等。不夸張地說(shuō)，沒(méi)有限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用就沒(méi)有基因工程的出現(xiàn)。限制性內(nèi)切酶可將大片段DNA剪切為小片段，從而大大促進(jìn)高等生物的遺傳學(xué)研究，人類基因組計(jì)劃的實(shí)施也得益于此(DNA限制性圖譜是其中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié))。限制性內(nèi)切酶被稱為DNA研究中的手術(shù)刀。通過(guò)特定限制性酶可實(shí)現(xiàn)基因染色體定位，可分析基因的化學(xué)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的特定區(qū)域等。限制性內(nèi)切酶在臨床上也具有巨大應(yīng)用，為先天性畸形、遺傳性疾病及腫瘤的預(yù)防和治療提供幫助。現(xiàn)在臨床的許多分子生物學(xué)診斷中，限制酶都是必備的工具，并因此成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中最為基本的應(yīng)用試劑。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了遺傳學(xué)的一場(chǎng)革命，對(duì)推動(dòng)分子生物學(xué)的發(fā)展具有不可估量的作用。

6 端粒酶的鑒定

染色體是真核生物遺傳信息的載體，其末端的特殊結(jié)構(gòu)端粒(telomeres)對(duì)防止不同染色體間末端融合和維持染色體的完整性具有重要意義。早在20世紀(jì)30年代，科學(xué)家就觀察到端粒結(jié)構(gòu)，但對(duì)這種結(jié)構(gòu)的特征知之甚少。澳大利亞和美國(guó)遺傳學(xué)家布萊克本(Elizabeth Helen Blackburn)首先在該領(lǐng)域取得突破。

布萊克本在澳大利亞墨爾本大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)位，1975年從劍橋大學(xué)獲得博士學(xué)位(導(dǎo)師是桑格教授)。她在耶魯大學(xué)博士后期間，利用剛剛建立起來(lái)的桑格測(cè)序法測(cè)定了四膜蟲(chóng)的端粒結(jié)構(gòu)，驚奇地發(fā)現(xiàn)它是由六核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列。1977年，布萊克本加入加州大學(xué)伯克利分校繼續(xù)進(jìn)行端粒研究，后與哈佛醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)家紹斯塔克(Jack William Szostak)進(jìn)一步確定酵母染色體端粒上也存在短重復(fù)序列，隨后對(duì)多種真核生物端粒結(jié)構(gòu)的鑒定說(shuō)明末端DNA重復(fù)是一種普遍現(xiàn)象。接下來(lái)的問(wèn)題是真核生物如何產(chǎn)生端粒，布萊克本認(rèn)為特定酶催化了該過(guò)程，而格雷德(Carol Widney Greider)最終證明該酶的存在。

格雷德從加州大學(xué)圣巴巴拉分校獲得生物學(xué)學(xué)位，1984年5月加入布萊克本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始博士學(xué)習(xí)，并對(duì)端粒延長(zhǎng)機(jī)制產(chǎn)生了濃厚興趣。格雷德首先利用生物化學(xué)方法鑒定是否存在具有催化端粒序列延長(zhǎng)的酶。由于對(duì)該酶的特性一無(wú)所知，因此只能摸索條件進(jìn)行。格雷德將通過(guò)酶切獲得的端粒模板和放射性標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸底物與四膜蟲(chóng)細(xì)胞核提取液混合，一段時(shí)間后提取DNA，檢測(cè)其長(zhǎng)度變化。不久，格雷德就從電泳結(jié)果中發(fā)現(xiàn)特異的六核苷酸重復(fù)，然而隨后發(fā)現(xiàn)這是由于DNA聚合酶催化的緣故。在經(jīng)歷多次失敗后，1984年底格雷德將原來(lái)的端粒模板換成人工合成的短六核苷酸重復(fù)，反應(yīng)完畢后利用電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生成一系列相差6個(gè)核苷酸的一系列DNA延長(zhǎng)產(chǎn)物，這是該酶存在的第一個(gè)證據(jù)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)排除了其他已發(fā)現(xiàn)酶特別是DNA聚合酶功能的前提下，她們最終確定細(xì)胞中存在一種催化端粒末端延長(zhǎng)的新酶，將其命名為端粒末端轉(zhuǎn)移酶(telomere terminal transferase)[12]，后簡(jiǎn)稱端粒酶(telomerase)(圖6)。格雷德和布萊克本深入研究證明端粒酶由RNA和蛋白兩部分構(gòu)成，蛋白部分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用RNA為模板將特定脫氧核苷酸依次添加到染色體末端。

圖6 布萊克本、格雷德與端粒酶

科學(xué)家進(jìn)一步對(duì)端粒和端粒酶研究后發(fā)現(xiàn)，端粒長(zhǎng)短與細(xì)胞壽命成正相關(guān)。隨著年齡的增加，端粒酶活性降低從而造成端粒長(zhǎng)度變短，細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型。相反，癌細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性持續(xù)性激活從而使細(xì)胞出現(xiàn)“不死性”。這些發(fā)現(xiàn)拓展了人們對(duì)衰老和腫瘤等相關(guān)疾病的認(rèn)識(shí)，從而為其治療提供新的療法。

2009年，布萊克本、紹斯塔克和格雷德由于 “端粒和端粒酶對(duì)于染色體保護(hù)作用”方面的發(fā)現(xiàn)而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

7 重組DNA技術(shù)的實(shí)現(xiàn)

酶學(xué)發(fā)展還直接推動(dòng)了技術(shù)革新，為生命科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展提供了重要工具，包括重組DNA技術(shù)、DNA酶法測(cè)序和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。重組DNA技術(shù)是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的方法之一，為許多問(wèn)題的解決帶來(lái)便利，而突破是在20世紀(jì)70年代初由美國(guó)科學(xué)家伯格(Paul Berg)首先完成。

伯格在賓夕法尼亞州立大學(xué)完成生物化學(xué)的學(xué)習(xí)后進(jìn)入俄亥俄州西儲(chǔ)備大學(xué)進(jìn)行博士學(xué)習(xí)，主要進(jìn)行一碳單位代謝的研究。1953年，伯格進(jìn)入圣路易斯華盛頓大學(xué)，先后研究了脂肪酸代謝、氨基酸活化等過(guò)程，鑒定出氨基酰-tRNA及相關(guān)酶類。1959年，伯格來(lái)到斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院擔(dān)任生物化學(xué)教授，開(kāi)始研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成機(jī)制，但研究材料由大腸桿菌轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，此外還接觸到SV40，并決定探索SV40中相關(guān)基因的功能。20世紀(jì)70年代初，限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)為分子生物學(xué)的研究帶來(lái)極大便利。伯格基本確定了SV40的基因分布，并測(cè)定了部分基因的核苷酸序列，接下來(lái)要確切獲悉特定的基因功能則需要首先讓基因表達(dá)出蛋白質(zhì)。由于SV40病毒侵染宿主細(xì)胞后可導(dǎo)致癌變，因此伯格考慮如將兩個(gè)不同物種間基因整合后再侵染細(xì)胞則可減弱致癌效應(yīng)。

伯格首先利用限制性內(nèi)切酶將SV40的DNA切割成一些短片段，然后利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈分子末端添加堿基，從而形成含有末端延長(zhǎng)的雙鏈DNA(該末端被稱為粘性末端)。伯格又用相同方法對(duì)λ噬菌體DNA進(jìn)行操作，從而也獲得擁有末端延長(zhǎng)的噬菌體DNA，且兩端添加的堿基恰好與SV40末端堿基互補(bǔ)配對(duì)。1972年，伯格和同事將兩者混合并最終獲得含有兩個(gè)物種DNA的雜合分子，第一次實(shí)現(xiàn)了體外DNA重組(圖7)[13]。

圖7 伯格和DNA重組技術(shù)

1980年，伯格由于“在核酸生物化學(xué)方面的基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)，特別是體外重組DNA的實(shí)現(xiàn)”而分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的一半。重組DNA技術(shù)開(kāi)創(chuàng)了遺傳工程的先河，一年后就實(shí)現(xiàn)了基因工程?；蚬こ炭纱蚱莆锓N限制，理論上可將任何物種間基因?qū)崿F(xiàn)有效整合，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展具有革命性影響。重組DNA技術(shù)一方面為基因操縱提供了一種強(qiáng)有力的工具，在基因結(jié)構(gòu)與功能、基因表達(dá)調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)基因研究等方面發(fā)揮了重要作用；另一方面還具有重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值，科學(xué)家利用簡(jiǎn)單生物如細(xì)菌作為宿主來(lái)表達(dá)大量感興趣的目的蛋白，如胰島素、生長(zhǎng)素、干擾素等。今天基因工程藥物的商業(yè)應(yīng)用已成為一個(gè)巨大且具有重大潛力的生命科學(xué)領(lǐng)域，是許多藥物和其他化學(xué)藥品的工業(yè)基礎(chǔ)。此外，重組DNA技術(shù)還為轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因治療等提供了重要手段。

8 DNA酶法測(cè)序的發(fā)明

桑格(Frederick Sanger)在劍橋大學(xué)完成化學(xué)學(xué)習(xí)，從20世紀(jì)40年代開(kāi)始進(jìn)行胰島素化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究，最終于1955年確定胰島素中氨基酸的排列順序，并因此榮獲1958年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。50年代，桑格成為劍橋醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室成員。60年代開(kāi)始，桑格開(kāi)始進(jìn)行RNA測(cè)序研究，采用類似蛋白質(zhì)測(cè)序基本原理——部分降解法。首先用特定核酸酶對(duì)RNA在特定堿基處切割，然后純化短片段RNA，進(jìn)一步利用化學(xué)降解確定小片段順序，最終通過(guò)重疊法推導(dǎo)出全長(zhǎng)RNA核苷酸序列。1967年，桑格小組利用這種方法確定了大腸桿菌5S rRNA序列(120個(gè)核苷酸構(gòu)成)。部分降解法涉及到連續(xù)降解和分離過(guò)程，因此整個(gè)過(guò)程相當(dāng)緩慢和繁瑣。盡管有科學(xué)家用這種方法進(jìn)行DNA測(cè)序，但是一般只能達(dá)到50個(gè)堿基，測(cè)定更長(zhǎng)DNA則顯得困難重重。然而，作為遺傳物質(zhì)的DNA一般都有幾千甚至上萬(wàn)堿基對(duì)，因此完成這項(xiàng)任務(wù)更是遙不可及。隨著DNA的重要性越來(lái)越得到科學(xué)界的認(rèn)可，DNA測(cè)序也就自然成為分子生物學(xué)領(lǐng)域需要迫切解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一，而傳統(tǒng)方法的弊端使科學(xué)界開(kāi)始尋找新的思路，桑格將注意力轉(zhuǎn)向了復(fù)制程序。

DNA聚合酶可利用DNA單鏈為模板，通過(guò)堿基配對(duì)獲得互補(bǔ)鏈，分析互補(bǔ)鏈的堿基序列可反推原DNA序列。桑格發(fā)現(xiàn)核苷三磷酸可代替脫氧核苷三磷酸摻入互補(bǔ)鏈，形成的互補(bǔ)鏈可被強(qiáng)堿試劑在核苷酸處斷裂，但對(duì)脫氧核苷酸無(wú)影響。根據(jù)添加到反應(yīng)體系中核苷三磷酸類型(如ATP)，就可確定斷裂位置堿基為A，原模板對(duì)應(yīng)位置為T(mén)。這種改進(jìn)較傳統(tǒng)方法有很大提高，但整個(gè)過(guò)程涉及大量分離與分析操作，仍然無(wú)法有效應(yīng)用于DNA測(cè)序。

1975年，桑格和庫(kù)爾森(Alan Coulson)改進(jìn)測(cè)序程序，提出了“加減法”[14]?；境绦颍菏紫仍诜磻?yīng)體系中加入待測(cè)DNA模板、合適引物、四種同位素標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸(dNTP)和DNA聚合酶，反應(yīng)一段后去除未反應(yīng)dNTP，將剩余部分進(jìn)行隨后的加法或減法程序。加法程序是將溶液分成四份，分別只加入一種dNTP(如dATP)。由于DNA聚合酶本身的3′→5′外切酶活性，因此對(duì)已生成的互補(bǔ)鏈進(jìn)行酶切；但由于添加了dATP，因此在堿基A處活性消失，最終獲得一系列以A為3′末端的長(zhǎng)短不一的片段。將這些片段在丙烯酰胺電泳中根據(jù)大小進(jìn)行分離，從而確定堿基A的位置。同樣原理獲得另外三種堿基位置。減法程序是將溶液分成四份，然后加入三種dNTP(如缺少dATP)。此時(shí)DNA聚合酶催化5′→ 3′延長(zhǎng)過(guò)程，由于dATP缺乏，因此延長(zhǎng)在A前一堿基處停止，最終亦生成大量長(zhǎng)短不一的片段。同樣利用電泳可確定堿基A位置(相應(yīng)片段長(zhǎng)度加1)。該方法可一次測(cè)定80個(gè)核苷酸，使用該方法，他們完成了單鏈?zhǔn)删wΦX174的5386核苷酸測(cè)序。這是第一個(gè)完成測(cè)序的基因組。加減法相對(duì)傳統(tǒng)方法有極大改善，但仍然非常費(fèi)力，且誤差較多。

1977年，桑格和同事對(duì)加減法進(jìn)行進(jìn)一步完善，引入雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)序，也被稱為“桑格法”或酶法[15]。雙脫氧核苷酸在結(jié)構(gòu)上與脫氧核苷酸類似，但缺失了3′羥基，因此可以和脫氧核苷酸類似被整合到延長(zhǎng)的核苷酸鏈，但由于羥基的缺失而造成進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)終止。桑格法基本程序：反應(yīng)體系分為四份，他們共同存在單鏈模板、同位素標(biāo)記的互補(bǔ)引物、四種dNTP和DNA聚合酶，然后四份中分別加入雙脫氧的A、T、G和C四種核苷酸，最終獲得四種分別以A、T、G和C為末端的長(zhǎng)短不一序列，利用丙烯酰胺電泳分離后借助放射自顯影確定堿基位置，最終確定模板的堿基順序(圖8)。

圖8 桑格和DNA測(cè)序

桑格的酶法測(cè)序是一個(gè)巨大突破，可實(shí)現(xiàn)快速、精確的長(zhǎng)鏈DNA測(cè)序。應(yīng)用該方法，桑格和同事先后完成人類線粒體DNA(16 569個(gè)堿基對(duì))和λ噬菌體(48 502個(gè)堿基對(duì))的測(cè)序工作。1986年，桑格法被胡德(Leroy Hood)進(jìn)一步改進(jìn)，用四色熒光代替同位素并實(shí)現(xiàn)測(cè)序自動(dòng)化。這種改進(jìn)更增強(qiáng)了測(cè)序的快速、便捷，在人類基因組測(cè)序中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。

1980年，桑格由于“核酸堿基序列確定方面的貢獻(xiàn)”而與吉爾伯特(Walter Gilbert)(化學(xué)法測(cè)序發(fā)明者)分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的一半。今天，桑格法測(cè)序已成為分子生物學(xué)研究必不可少的方法之一，對(duì)推動(dòng)生命科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

9 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明

DNA是遺傳信息的載體，對(duì)它的研究成為基礎(chǔ)研究和商業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)。然而研究過(guò)程中如何得到大量DNA是一個(gè)最基本的問(wèn)題。最早利用大腸桿菌體內(nèi)擴(kuò)增技術(shù)雖使這一問(wèn)題得到部分解決，但存在兩大弊端，一是耗時(shí)，二是需要擴(kuò)增整個(gè)DNA從而增加復(fù)雜性，因此無(wú)法很好滿足實(shí)際需要。直到美國(guó)工程師穆里斯(Kary Banks Mullis)發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)才真正解決問(wèn)題。

穆里斯從小就對(duì)科學(xué)充滿興趣且極富個(gè)性，在高中時(shí)就設(shè)計(jì)成功簡(jiǎn)易火箭，并攜帶一只青蛙升高到7 000英尺高空，隨后打開(kāi)降落傘使活的青蛙安全返回地面。穆里斯選擇以理工見(jiàn)長(zhǎng)的喬治亞理工學(xué)院學(xué)習(xí)化學(xué)，在這里建造了一個(gè)生產(chǎn)毒藥和爆炸物的實(shí)驗(yàn)室，而且還發(fā)明了由腦電波刺激的電子設(shè)施以控制電的開(kāi)關(guān)。1966年他獲得化學(xué)學(xué)士學(xué)位，1973年從加州大學(xué)伯克利分校獲得生物化學(xué)博士學(xué)位。

由于對(duì)大學(xué)教育的失望和對(duì)未來(lái)感到茫然，穆里斯于1979年離開(kāi)加州大學(xué)舊金山分校，進(jìn)入加州新建的Cetus生物科技公司。該公司主要進(jìn)行化合物合成，以提供其他科學(xué)家進(jìn)行遺傳克隆研究。在工作期間，穆里斯對(duì)公司的日常要求感到厭倦，因此花費(fèi)大量時(shí)間在屋頂進(jìn)行日光浴，還有就是書(shū)寫(xiě)計(jì)算機(jī)程序以能夠自動(dòng)對(duì)工作要求進(jìn)行反應(yīng)。穆里斯認(rèn)為真正好的科學(xué)發(fā)明并非來(lái)自于艱苦工作，真正的重大進(jìn)展往往是由具有好動(dòng)性格的邊緣人士完成的。

1983年，穆里斯乘車去加利福尼亞州西北部門(mén)多西諾角農(nóng)場(chǎng)時(shí)，構(gòu)思了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，提出可使用一種隨機(jī)方式進(jìn)行遺傳物質(zhì)擴(kuò)增。當(dāng)穆里斯將自己的想法介紹給同事時(shí)，他們并沒(méi)有意識(shí)到該方法的重要性；而等到Cetus公司意識(shí)到該思想的重要性后，該研究就迅速成為公司的中心問(wèn)題。1985年，穆里斯和同事使用血紅蛋白β亞基DNA兩端分別互補(bǔ)的兩端20個(gè)堿基寡核苷酸為引物，通過(guò)變性、退火和延伸20個(gè)重復(fù)反應(yīng)(圖9)，最后獲得1 μg血紅蛋白β亞基DNA擴(kuò)增片段[16]。最早PCR反應(yīng)存在兩大弊端：一是所用DNA聚合酶是從大腸桿菌中得到的Klenow大片段，具有熱不穩(wěn)定性，高溫易變性，且每一周期反應(yīng)(變性、退火和延伸)都需重新加入一次酶試劑，大大限制該技術(shù)的應(yīng)用；二是缺乏自動(dòng)化。一開(kāi)始設(shè)置三個(gè)不同溫度的溫箱，根據(jù)需要在三個(gè)溫箱中進(jìn)行溫度變化，因此非常繁瑣。1988年使用Tag DNA聚合酶代替Klenow大片段，該酶熱穩(wěn)定強(qiáng)，整個(gè)反應(yīng)只需添加一次即可，這也促進(jìn)自動(dòng)化的出現(xiàn)。研究人員又設(shè)計(jì)出溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可預(yù)先設(shè)置溫度，然后在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)需要實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)。隨著PCR技術(shù)優(yōu)越性的廣泛體現(xiàn)及需求增多，很快成功開(kāi)發(fā)出商業(yè)用途的版本。該機(jī)器被稱為熱循環(huán)器，只需加入DNA模板、引物、四種核苷酸、DNA聚合酶以及合適的緩沖液，再設(shè)定條件就可自動(dòng)合成一段特異DNA片段。這樣的機(jī)器經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，即使一個(gè)小的實(shí)驗(yàn)室也可承擔(dān)，科學(xué)家評(píng)論該機(jī)器甚至比自然界有更高的復(fù)制效率。

圖9 穆里斯和PCR

1993年，穆利斯由于“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法”的發(fā)明而分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR的出現(xiàn)在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)和考古學(xué)引發(fā)了一場(chǎng)革命，推動(dòng)了DNA克隆、DNA測(cè)序、基因功能分析等方法學(xué)的革新。沒(méi)有PCR技術(shù)，今天人類基因組計(jì)劃根本無(wú)法完成。PCR技術(shù)還在進(jìn)化生物學(xué)領(lǐng)域引起了一場(chǎng)革命，可以對(duì)古生物遺留的痕量DNA實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，以了解它們的演化過(guò)程。此外，PCR技術(shù)還在法醫(yī)鑒定、遺傳性疾病診斷、傳染性疾病研究等方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

上面重點(diǎn)介紹的分子生物學(xué)相關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)成果已充分體現(xiàn)酶對(duì)分子生物學(xué)發(fā)展的重要性。此外，其他一些成果，如比德?tīng)?George Wells Beadle)和塔特姆(Edward Lawrie Tatum)提出的“一個(gè)基因一個(gè)酶”(1958年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))、莫諾(Jacques Lucien Monod)和雅各布(Fran?ois Jacob)研究β-半乳糖苷酶提出的操縱子假說(shuō)(1965年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))、法厄(Andrew Zachary Fire)和梅洛(Craig Cameron Mello)發(fā)現(xiàn)的RNA干擾現(xiàn)象中的Dicer酶(2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))中酶也具有重要地位。目前，分子生物學(xué)前沿領(lǐng)域如表觀遺傳學(xué)也與酶密不可分。表觀遺傳學(xué)主要涉及DNA甲基化、RNA干擾和組蛋白修飾等，相關(guān)酶包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶/去乙?；浮⒔M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶/去甲基化酶等，在該領(lǐng)域做出卓越貢獻(xiàn)的科學(xué)家也有望摘取諾貝爾獎(jiǎng)。

總之，酶是生命的“媒介”，對(duì)生命而言具有至關(guān)重要的意義。其在分子生物學(xué)發(fā)展過(guò)程中功不可沒(méi)，為推動(dòng)這一領(lǐng)域的快速發(fā)展發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。由于篇幅所限，無(wú)法展現(xiàn)60多年來(lái)分子生物學(xué)酶發(fā)展的全貌(如DNA連接酶等發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用)，只通過(guò)一個(gè)輪廓性介紹展現(xiàn)酶的重要性，以此紀(jì)念DNA雙螺旋提出60周年。

(2013年10月14日收稿)

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(編輯：沈美芳)

Enzymes and life sciences (Ⅲ): Discovery and utilization of molecular biology enzymes

GUO Xiaoqiang
Department of Chemical Engineering, Shijiazhuang Vocational Technology Institute, Shijiazhuang 050081, China

In the last half of 20th century, molecular biology has made rapid development in life science. The discovery and application of molecular biology enzymes play an important role in promoting it. Several enzymes were identified and clarified including DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, restriction endonuclease, and telomerase. The progresses expand the understanding of many life phenomena. These enzymes also were used in molecular biology techniques, known as recombinant DNA, Sanger sequencing and polymerase chain reaction, which have a variety of applications such as nucleic acid manipulation, DNA sequencing and amplif i cation. In the paper, the history of researches on molecular biology enzymes was described to understand the signif i cance of these enzymes.

molecular biology enzyme, DNA polymerase, reverse transcriptase, restriction endonuclease, molecular biology technique, Nobel Prize

10.3969/j.issn.0253-9608.2015.05.008

?通信作者，E-mail：xiaoqiangguo123@163.com