高守翠，成大欣，趙四海，2，陳玉龍，王曉靖，白亮，范江霖，3，劉恩岐，2

(1.西安交通大學心血管研究中心脂代謝與動脈粥樣硬化研究室，西安 710061;2.西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，西安 710061;3.山梨大學醫(yī)學部分子病理學系，日本 山梨 409－3898)

基因修飾動物模型是當今生物醫(yī)學研究的主要工具，主要包括基因敲除和轉基因動物模型。在研究候選基因在疾病發(fā)生中的作用及其分子機制時，往往需要改變其在體內的表達水平，比如高表達和敲低或敲除，從正反兩方面揭示其參與疾病的機制?；蛐揎椉夹g已逐漸推廣到大多數常用實驗動物。家兔是常用實驗動物之一，與大鼠和小鼠相比，其體型相對較大，便于取材和手術操作。由于家兔的生物學特征，其在心血管疾病、生物反應器、免疫學和病毒學等研究領域被廣泛應用［1－4］。轉基因家兔在這些領域也被廣泛用來研究相關疾病的發(fā)病機制，尤其是在心血管疾病研究領域。人膽固醇酯轉移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)是一個極度疏水的糖蛋白，包含476個氨基酸，其中非極性氨基酸占45%，在膽固醇逆向轉運中，CETP能夠促進膽固醇酯從高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)轉運到含載脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)的脂蛋白顆粒中，同時反向轉運甘油三酯(triglyceride，TG)，抑制CETP可能能夠增加循環(huán)中HDL水平的升高。近年來CETP因參與血漿脂蛋白膽固醇水平的調控和脂蛋白顆粒的重塑，在脂蛋白代謝中的作用倍受重視［5］。但是，CETP究竟是抗心血管疾病發(fā)生因子還是促進心血管疾病因子一直存在爭議［6］。為了研究CETP參與血脂代謝和炎癥進而參與動脈粥樣硬化的分子，我們設計了人CETP肝臟細胞特異性表達載體，用顯微注射方法制作CETP轉基因家兔，為研究CETP與心血管疾病，主要是動脈粥樣硬化的關系提供動物模型。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性、雄性SPF級日本大耳白兔各50只，3月齡，體重2.5 kg左右，來源于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心【SCXK(陜)2012－003】。動物飼養(yǎng)室的溫度、光照、噪聲和換氣次數等均符合國標要求(GB14925－2010)，自由飲水和采食。該研究通過了西安交通大學實驗動物管理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器

卵泡刺激素和絨毛膜促性腺激素(寧波市三生藥業(yè)有限公司，中國)，透明質酸酶(Sigma，美國)、2× PCR Mix、反轉錄和 rael－time PCR 試劑(Takara，日本)，質粒、血液或組織全基因組DNA、總RNA和總蛋白質提取試劑盒(Omega，美國)，CETP抗體(Abcam，英國)和活性鑒定試劑盒(BioVision，中國)，Sal I內切酶(Fermentas，立陶宛)，M2 和 M16培養(yǎng)液(自制)。儀器:P－97 拉針儀(Sutter，美國)，MF－900燒針儀(Narishige，日本)，體視顯微鏡(O－lympus，日本)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，顯微注射系統(tǒng)(Eppendorf，德國)，PCR 儀(Eppendorf，德國)，蛋白電泳系統(tǒng)(Bio－Rad，美國)。

1.3 轉基因動物制作［7］

人CETP轉基因家兔制作采用經典的顯微注射方法。動物實驗操作在西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心進行【SYXK(陜)2012－005】。

1.3.1 基因載體構建

將人CETP(cDNA，NM_000078)基因克隆連接到pJC13質粒，置于apoE啟動子控制之下，以控制其在肝臟特異性表達，擴增、純化后用于顯微注射。

1.3.2 激素注射程序

給供體雌性家兔皮下注射卵泡刺激素誘導同期發(fā)情，每隔0.5 IU/12 h，共注射3 d 6次。供體雌兔在實驗第4天進行自然交配或人工授精，隨后肌肉注射絨毛膜促性腺激素150 IU，刺激卵巢排卵。

1.3.3 準備代孕雌兔

實驗第4天，代孕雌兔與供體兔同時注射150 IU hCG，使代孕雌兔子宮、輸卵管與顯微注射后的受精卵處于生理同期。

1.3.4 收集受精卵和顯微注射

實驗第5天，過量麻醉處死供體兔，打開腹腔取其輸卵管、部分子宮和卵巢。用M2培養(yǎng)液沖洗輸卵管，收集得受精卵并沖洗。受精卵轉移至M16培養(yǎng)液，至于二氧化碳培養(yǎng)箱備顯微注射。將受精卵轉移至顯微注射平臺，調整持卵針和顯微注射針。在低倍鏡定位受精卵，200倍視野下觀察，可明顯觀察到兩個原核的卵為受精卵。移動持卵針向備注射的受精卵，利用負壓固定受精卵，注射針刺入雄性原核并進行目的基因溶液的注射，觀察到雄原核稍膨脹，拔掉注射針。

1.3.5 胚胎移植

麻醉代孕雌兔，取俯臥位，脊柱旁側開0.5～1 cm切口，用平鑷夾住卵巢上方的脂肪墊，將輸卵管拉出腹腔。將顯微注射完的受精卵用自制移卵管移植到受體兔輸卵管，稍停頓以避免受精卵流失。移植完畢將輸卵管送回腹腔。

1.3.6 模型鑒定

將離乳后仔兔剪去少許組織或采150 μL血，提取基因組 DNA，進行 PCR 檢測。Sense，5＇－TCAGCCACTTGTCCATCGC－3＇;Anti－sense， 5＇－GGCATCGGTCCGCACTCTA－3＇，產物大小:230 bp。程序:95℃10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共進行35 個循環(huán)，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(20 g/L)。

1.4 目的基因表達分析

將F0代CETP轉基因家兔禁食16 h，抽血，3000 r/min離心分離血漿，檢測血漿中CETP的表達和活性和總膽固醇(total cholesterol，TC)。繁殖CETP轉基因家兔，處死F1代轉基因家兔1只和同窩非轉基因家兔1只，按試劑盒說明書提取各主要臟器總蛋白和總RNA備用。Rael－time PCR CETP用引物序列同上，家兔GAPDH引物序列:Sense，5＇－ATCACTGCCACCCAGAAGAC－3＇;Anti－sense，5＇－GTGAGTTTCCCGTTCAGCTC－3＇，PCR 反應反應體系為SYBR?Premix Ex TaqTMII(10 μL)，上下游引物各1 μL(10 mol/L)，cDNA 模板1 μL，加雙蒸水7.0 μL。反應條件:95℃ 30 s開始程序，95℃ 5 s，55℃ 40 s共40個循環(huán)。CETP Western blot和活性測定，按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 基因構建

pJC13－apoE－h(huán)CETP 質粒構建成功 (圖 1A)，ApoE啟動子用于控制人CETP基因的組織特異性表達。含有目的基因的質粒載體擴增、提取后酶切，線性化目的基因用于顯微注射(圖1D)。

2.2 目的基因注射與模型鑒定

收集受精卵后，將目的基因溶液注射到雄原核，雄原核稍膨大(圖1B，C)，注射后的受精卵進行胚胎移植。代孕家兔產下仔兔，離乳后抽取150 μL血樣，提取全基因組DNA進行常規(guī)PCR檢測，PCR產物瓊脂糖電泳結果顯示我們獲得了人CETP轉基因陽性家兔(圖1E)。

2.3 轉基因效率

注:A.轉基因載體設計;B，C.顯微注射;D.轉基因載體的準備;E.仔兔轉基因攜帶情況檢測。M.DNA marker;P.質粒;D 1～3.SalⅠ酶切后的質粒;E.－陰性對照;+陽性對照;E1～5:仔兔基因PCR擴增產物樣本。圖1 轉基因載體的準備Note.A.Design of the transgenic vector preparation;B，C.Microinjection;D.Preparation of transgenic vector;E.Detection of offsprings carrying the transgenes;M.DNA marker;P.Plasmids;Fig.1D 1－3.Plasmid after Sal I enzyme digestion;Fig.1E. － Negative control，+Positive control;Fig.1E1～5.Samples of PCR product amplification of the offspring genes.Fig.1 Preparation of transgene，microinjection and the PCR test results of the offsprings

本次人CETP轉基因家兔制作實驗中，共收集到1522枚受精卵，有868枚受精卵適合顯微注射。顯微注射后移植入32只受體兔，其中11只受孕(34.3%)，產仔45只，轉基因陽性幼兔1只，轉基因效率約為2.2%。

2.4 轉基因表達與活性

Western Blot方法被用來檢測了人CETP轉基因家兔中CETP轉基因的表達，由于人CETP轉基因和家兔內源性CETP具有交叉反應，故未能確定其表達量。Real－time PCR檢測結果發(fā)現，在轉基因家兔各主要組織器官中，人CETP轉基因主要在肝臟表達，與設計的相一致(圖2)。血漿中CETP的活性檢測結果顯示，轉基因家兔CETP活性為每小時25.2 pmol/μL，同窩非轉基因家兔CETP活性為每小時17.2 pmol/μL，轉基因家兔活性高于非轉基因家兔。轉基因家兔血漿TC為19 mg/dL，同窩非轉基因家兔血漿TC為18 mg/dL，但轉基因家兔血漿HDL－C為4 mg/dL，顯著低于非轉基因家兔的12 mg/dL。

注:1.肝;2.心臟;3.脾;4.肺;5.腎;6.腎上腺;7.脂肪;8.肌肉;9.睪丸;10.主動脈弓;11.肺巨噬細胞;12.腦;13.脊髓;14.小腸。圖2 人CETP轉基因在模型家兔主要器官/組織的mRNA表達水平Note.1.Liver，2.Heart，3.Spleen，4.Lungs，5.Kidneys，6.Adrenal glands，7.Fat，8.Muscle，9.Testes，10.Aortic arch，11.Pulmonary macrophages，12.Brain，13.Spinal cord，14.Small intestine.Fig.2 The mRNA expression levels of human CETP transgene in the main organs/tissues of transgenic rabbits

3 討論

轉基因家兔作為重要的生命醫(yī)學研究用動物模型，在心血管疾病、感染性疾病以及代謝性疾病等的研究中具有重要的科研價值，隨著生物技術的發(fā)展，它在生命醫(yī)學研究的其他領域也越來越受到重視［4，7－9－11］。目前為止，顯微注射法仍是制作轉基因動物的最常用方法之一。在本研究中，我們利用顯微注射方法制作成功人CETP轉基因家兔，為相關研究提供了良好的候選動物模型。CETP作為可能的心血管疾病的治療靶點，最近幾年很受研究人員重視，并投入了很多精力進行相關研究。雖然CETP轉基因小鼠已經研發(fā)成功，但利用該模型取得的研究成果仍存在很多爭議［4，7－9］。這與小鼠本身的生物學特性有很大關系，小鼠脂質代謝與人類的差異是其可能原因之一。小鼠體內富含HDL，ApoE敲除后HDL和LDL均升高，其動脈粥樣硬化病變與人類存在差異，小鼠缺乏CETP，導致其膽固醇代謝與人類存在差異［10］。因此基于小鼠等嚙齒類動物模型的有關CETP的研究可能存在一定先天性缺陷。

目前針對CETP抑制劑的研究陷于相對被動的局面［11］。這其中的一個重要原因可能是先期動物模型的選擇存在問題，大多基于嚙齒類模型的研究結果尚需進一步確證。在本研究中我們建立了人CETP轉基因家兔，該模型在肝臟特異性高表達人CETP，并釋放入血。血漿檢測CETP活性在轉基因家兔明顯升高，并最終影響了血漿HDL－c的濃度。這些特征表明該模型在CETP與心血管疾病的研究中具有重要的應用價值。家兔屬于兔形目動物，在系統(tǒng)發(fā)育上比嚙齒類實驗動物更接近人類;家兔脂蛋白特征與人類相似，富含LDL，脂蛋白代謝更適合人類心血管疾病研究，另外，與嚙齒類動物相比，家兔體型大，更容易進行主要臟器功能檢測、血液生化學分析和實驗操作［10］。在他汀類藥物的發(fā)現、藥效評價和最終被應用的歷史中，他汀類藥物在嚙齒類動物中的研究結果趨于陰性結論，但在家兔模型的研究中展現出良好的降血脂作用，這為他汀類藥物最終得以發(fā)掘和應用于臨床起到了重要推動作用［12］。本模型的研發(fā)成功和應用，必將進一步加深研究者對CETP和動脈粥樣硬化相關疾病關系的認識。

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