任 潔 盧建華

RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)與絕經(jīng)后骨質疏松模型的研究

任 潔 盧建華

RANKL/RANK/OPG；絕經(jīng)后骨質疏松；護骨素；MiR-503；腫瘤壞死因子-a

絕經(jīng)后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指絕經(jīng)后的婦女由于卵巢功能減退，雌激素不分泌或者分泌過少，骨吸收大于骨形成，形成高轉化型的骨質疏松特點。臨床研究[1-2]發(fā)現(xiàn)：＞60歲的女性發(fā)病率高達24%，中老年女性診斷為骨質疏松是男性的3倍。絕經(jīng)后骨質疏松模型是通過切除動物的卵巢，造成雌激素分泌減少，來模擬PMOP。雌激素的減少破壞了骨吸收和骨形成的平衡，而RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)存在于骨吸收過程中，必然受到雌激素的影響。因此，本文主要針對RANKL/ RANK/OPG系統(tǒng)與絕經(jīng)后骨質疏松動物模型的成果進行研究，現(xiàn)綜述如下。

1 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)

細胞核因子kB受體活化因子配體（the nucleus factor kB receptor activation factor ligands，RANKL），即破骨細胞分化因子，屬于TNF家族，發(fā)現(xiàn)于成骨細胞表面，為Ⅱ型跨膜蛋白。核因子kB受體活化因子（nuclear factor kB receptor activation factor，RANK）為Ⅰ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，存在于破骨細胞及其祖細胞表面，是RANKL的唯一靶信號受體。護骨素（osteoprotegerin，OPG）又稱骨保護蛋白，是一種可溶性的分泌型糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，由成骨細胞合成和分泌。RANK信號轉導的主要3個單獨途徑[3-5]包括：①蛋白酶c-允un氨基末端激酶（c-允un N-terminal kinase，允NK）途徑，調節(jié)c-fos和c-jun（c-fos和c-jun是轉錄調節(jié)因子，屬亮氨酸拉鏈家族成員）；②核因子kB（nuclear factor kB，NF-kB）途徑，調節(jié)破骨細胞生成和蛋白酶的產(chǎn)生；③絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt（又稱蛋白激酶B，protein kinase B，PKB）途徑，抑制凋亡，調節(jié)細胞骨架重排，可能與NF-kB途徑有交叉。

RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)作用于骨重建的骨吸收過程中。在骨吸收過程中，許多上游的細胞因子（如雌激素、糖皮質激素、腫瘤壞死因子等）會影響成骨細胞分泌RANKL和OPG；此外存在于破骨細胞循環(huán)祖細胞—CD14+外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）上的小核糖核酸-503（mini ribonucleic acid-503，miR-503）能調控RANK表達[6]。當RANKL作用于破骨細胞前體上的受體RANK時，觸發(fā)破骨細胞的成熟，并阻止破骨細胞的凋亡延長其壽命，從而誘導骨吸收。而OPG通過競爭性結合RANKL，從而減少RANKL與RANK結合，抑制破骨細胞的分化成熟、誘導破骨細胞凋亡。當局部微環(huán)境中的RANKL/OPG濃度比升高時，破骨細胞的活躍度增加，引起骨密度的下降，造成骨質疏松。

2 絕經(jīng)后骨質疏松模型

目前用于研究骨質疏松癥的模型有許多種類，主要包括絕經(jīng)后、老年型、激素型、廢用型以及其它藥物誘導的模型。其中絕經(jīng)后的模型通過切除動物的卵巢（ovariectomized，OVX），從而引起雌激素的減少，來模擬絕經(jīng)后骨質疏松癥。對于動物的選擇，主要包括嚙齒動物、兔、羊、非人類靈長類動物等。1969年由Svallie首次建立了大鼠絕經(jīng)后骨質疏松動物模型。雌性大鼠在行卵巢切除術后，骨吸收大于骨形成，松質骨的骨轉化加快、骨量減少、骨強度下降，這種骨代謝的變化與早期絕經(jīng)后婦女相類似。楊林等[7]研究去勢大耳兔脊柱骨發(fā)現(xiàn)：去勢后3個月兔腰椎骨開始呈現(xiàn)骨質疏松表現(xiàn)，術后4個月可形成可靠的骨質疏松模型。Liu等[8]采用OVX綿羊，并從切除卵巢后第四周開始按0.45mg/kg進行肌注甲強龍，持續(xù)10個月，并在最后4周逐漸減少甲強龍的注射量，在卵巢切除12個月后腰椎BMD下降超過25%，成功構建了骨質疏松羊模型。1986年首次報道了使用非人類靈長類動物構建骨質疏松模型，靈長類動物在行OVX術9個月后進行藥物干預治療，治療應至少持續(xù)16個月[9]。OVX骨質疏松模型主要是由于雌激素減少，影響骨吸收和骨形成的平衡，造成骨量減少、骨微結構破壞，引起絕經(jīng)后骨質疏松癥。但是，目前用于RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)方面研究的OVX骨質疏松模型主要集中在鼠類模型上[10-13]。

3 絕經(jīng)后骨質疏松模型與RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)

絕經(jīng)后的骨質疏松模型通過將動物的卵巢切除，造成雌激素分泌減少，引起骨吸收大于骨形成，從而構建高轉化型的骨質疏松模型。而RANKL/ RANK/OPG系統(tǒng)是骨吸收過程中一條重要的途徑，因此雌激素減少引起的骨質疏松必然與之有一定的聯(lián)系。雌激素影響骨重塑主要通過2條途徑：一方面，雌激素通過與破骨細胞和成骨細胞上的雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合，直接調節(jié)骨代謝[14-15]；另一方面，雌激素通過與ER結合，調節(jié)各種細胞因子的分泌，如：OPG、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、白細胞介素-1（interleukins-1，IL-1）、白細胞介素-6（interleukins-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以及胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）。其中OPG和TNF-α參與RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)，影響RANKL的表達。當雌激素減少時，OPG分泌減少，RANKL/ OPG濃度比升高，RANKL與RANK結合增加，促進破骨細胞的分化成熟，骨吸收大于骨形成，引起骨質疏松。而此時TNF-α表達增加，TNF-α通過前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）誘導RANKL的表達并降低OPG的表達，從而促進破骨細胞生成、分化和成熟。此外，雌激素減少后，小核糖核酸miR-503在PBMCs上明顯減少，RANK表達增加，骨吸收活躍，引起骨質疏松。以下是對絕經(jīng)后骨質疏松模型與RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)在OPG、TNF-α及miR-503方面的相關的研究進展。

3.1 OPG OPG對破骨細胞的形成具有決定性作用，可以作為骨量調節(jié)過程中的一個可溶性因子，并可用來治療破骨細胞增加相關的骨質疏松癥[16]。而雌激素可以通過ER-α而不是ER-β影響成骨細胞產(chǎn)生OPG[17]。在相關實驗研究[18]方面，OVX組的大鼠與正常組相比，雌激素水平降低，OPG的基因表達減少，而RANKL基因表達增加，M-CSF無顯著差異，大鼠的中軸骨和四肢骨上的破骨細胞數(shù)增加以及骨密度下降。那么是否可以通過干預來促進OPG的分泌，使RANKL/OPG濃度比降低，從而抑制雌激素減少引起的骨吸收。王強等[19]通過跑臺運動來治療去卵巢大鼠骨質疏松，結果發(fā)現(xiàn)，和去卵巢組比較,跑臺運動組的OPG的mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義；認為力學刺激能通過促進去卵巢大鼠骨組織中OPG的表達而發(fā)揮其抗絕經(jīng)后骨質疏松的效果。Spilmont等[20]在研究石榴籽油（pomegranate seed oil，PSO）對OVX小鼠防止骨質流失中發(fā)現(xiàn)含PSO血清直接或間接地增加成骨細胞分化和抑制破骨細胞形成，其中OPG轉錄水平顯著升高（達到治療前的4.4倍），RANK的表達顯著下調（0.51倍，P＜0.05）。Ma等[21]通過果糖二磷酸鍶鹽治療OVX大鼠，結果顯示，骨密度、骨微結構及骨強度顯著改善，血清中的RANKL水平下降、OPG水平增加，骨髓中的RANKL基因表達減少、OPG基因表達增加。

但是也有報道[22-23]，隨雌激素水平降低，骨組織OPG的表達卻升高。推測可能雌激素水平突然降低，機體啟動應激保護機制，骨吸收和骨形成相互偶聯(lián)，骨重建代償性增加，從而引起OPG表達升高。

3.2 TNF-α 雌激素缺乏引起的骨質流失中最重要的細胞因子是骨髓T淋巴細胞產(chǎn)生的TNF-α[24]。雌激素通過影響TNF-α和IL-1，進而影響成骨細胞表達RANKL，TNF-α抑制劑能顯著減少雌激素缺乏引起骨吸收增加的影響[25-26]。Roggia等[27]研究發(fā)現(xiàn)，①來自于切除卵巢小鼠的T細胞培養(yǎng)產(chǎn)生TNF的數(shù)量增加，引起RANKL的表達增加，進而導致破骨細胞形成；②卵巢切除術在野生型（wild type，WT）小鼠能快速誘導骨質流失，而在TNF-/-小鼠上不行；③卵巢切除術引起的骨質流失，在T細胞缺陷的小鼠上沒有發(fā)揮作用，當從WT小鼠移植T細胞則恢復骨質流失，但是從TNF-/-小鼠上移植T細胞則不行。這些結果表明雌激素缺乏引起骨質疏松的主要機制是通過增加骨髓T細胞數(shù)量，進而增加TNF的表達，引起RANKL的表達增加，促進破骨細胞形成。那么是否可以通過增加雌激素來抑制TNF-α的表達？在實驗研究方面，段永宏等[28]用選擇性雌激素受體調節(jié)劑-雷諾昔芬治療去勢后大鼠，結果表明經(jīng)雷諾昔芬治療后的OVX小鼠骨小梁周圍及髓腔內TNF-α陽性表達明顯減弱，接近假手術組水平；這表明雷諾昔芬起到了類似雌激素的保護作用，抑制了由TNF-α誘導而產(chǎn)生的骨吸收，減弱了因雌激素缺乏引起的骨質疏松癥。在臨床研究方面，劉景科等[29]通過青娥方治療絕經(jīng)后骨質疏松伴有骨痛患者，通過測定治療前后血清中的TNF-α，發(fā)現(xiàn)TNF-α水平降低，可抑制絕經(jīng)后代謝性骨丟失，促進骨形成。

3.3 MIR-503 目前，對于小分子核糖核酸在破骨細胞形成和骨吸收方面的研究較少，而miR-503通過RANK調控破骨細胞形成。在OVX小鼠上，使用miR-503拮抗劑，抑制其表達，引起RANK蛋白表達增加，促進骨吸收、骨量減少；當使用miR-503激動劑時，miR-503超表達，抑制骨吸收和骨量減少[6]。

4 展望

以上研究表明，絕經(jīng)后骨質疏松動物模型通過卵巢切除，引起雌激素的缺乏，導致OPG、MIR-503表達降低和TNF-α表達增加，進而影響RANKL/ RANK/OPG信號通路，最終促進破骨細胞活化、分化、成熟以及阻止破骨細胞凋亡，快速誘導骨質流失。目前用于RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)方面研究的OVX骨質疏松模型主要集中在鼠類模型上。雌性鼠在行卵巢切除術后，骨代謝的變化與早期絕經(jīng)后婦女相類似：骨吸收大于骨形成，松質骨的骨轉化加快、骨量減少、骨強度下降。因此，OVX骨質疏松動物模型對于絕經(jīng)后骨質疏松癥模擬是可行的，并在RANKL/RANK/OPG信號通路上的研究也有一定進展。但是雌激素的缺乏并不是僅僅通過RANKL/ RANK/OPG這一條通路引起骨質流失，還可以通過雌激素受體等其它生物因子影響骨重塑，因此還有待進一步研究。此外，基于OVX骨質疏松模型的RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)方面研究在其他動物模型上有待進一步開發(fā)。

［1］Li W，Liu C，Wang H.Screening for specific biomarkers in the serum of postmenopausal osteoporosis patients using proteomic fingerprint techniques［J］.Biomed Rep，2013，1（1）：129-133.

［2］Wilhelm M，Roskovensky G，Emery K，et al.Effect of resistance exercises on function in older adults with osteoporosis or osteopenia：a systematic review［J］.Physiother Can，2012，64（4）：386-394.

［3］Yu M，Chen X，Lv C，et al.Curcumol suppresses RANKL-induced osteoclast formation by attenuating the允NK signaling pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，447（2）：364-370.

［4］Liu W，Wang S，Wei S，et al.Receptor activator of NF-kappaB（RANK）cytoplasmic motif，369PFQEP373，plays a predominant role in osteoclast survival in part by activating Akt/PKB and its downstream effector AFX/FOXO4［J］.允Biol Chem，2005，280（52）：43064-43072.

［5］Moriwaki S，Suzuki K，Muramatsu M，et al.Delphinidin,one of the major anthocyanidins,prevents bone loss through the inhibition of excessive osteoclastogenesis in osteoporosis model mice［J］.PLoS One，2014，9（5）：e97177.

［6］Chen C，Cheng P，Xie H，et al.MiR-503 regulates osteoclastogenesis via targeting RANK［J］.允Bone Miner Res，2014，29（2）：338-347.

［7］楊林，劉建民，趙愛蓮，等.去勢大耳兔脊柱骨的CT形態(tài)及QCT骨密度測定分析［J］.中國骨質疏松雜志，2012，18（1）：21-23.

［8］Liu D，Zhang Y，Zhang B，et al.Comparison of expansive pedicle screw and polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw in osteoporotic sheep lumbar vertebrae∶biomechanical and interfacial evaluations［J］.PLoS One，2013，8（9）：e74827.

［9］Smith SY，Jolette J，Turner CH.Skeletal health:primate model of postmenopausal osteoporosis［J］.Am允Primatol，2009，71（9）：752-765.

［10］Lee EJ，Kim JL，Kim YH，et al.Phloretin promotes osteo

浙江省自然科學基金項目（No.Y206272）

浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（杭州 310053）

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