陳碧瑤 李 斌 韋思明 王 力

缺血后處理對(duì)大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響

陳碧瑤 李 斌 韋思明 王 力

目的 觀察缺血后處理對(duì)大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響。方法 60只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注組和缺血后處理組，每組20只。對(duì)照組行左側(cè)睪丸假手術(shù)。缺血再灌注組予左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)720度，2h后復(fù)位。缺血后處理組予左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)720度，2h后行缺血后處理，即先將睪丸復(fù)位，血流再灌注10s，然后將睪丸再次扭轉(zhuǎn)720度，使睪丸缺血10s，反復(fù)6個(gè)循環(huán)，最后睪丸復(fù)位，血流持續(xù)灌注。復(fù)位后4h，每組處死大鼠10只，行左側(cè)睪丸切除術(shù)，測(cè)定睪丸組織丙二醛水平。復(fù)位后3個(gè)月，各組處死剩余的大鼠，行左側(cè)睪丸切除術(shù)，分析睪丸生精功能。結(jié)果睪丸組織丙二醛含量缺血后灌注組＞缺血后處理組＞處理組［（2.73±0.34）、（1.86±0.29）、（1.45± 0.20）mmol/mg］（P＜0.05），睪丸生精功能對(duì)照組＞缺血后處理組＞缺血后灌注組［（22.03±1.97）、（15.13±1.81）、（2.14±0.42）×106］（P＜0.05）。結(jié)論 缺血后處理對(duì)睪丸缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低活性氧水平有關(guān)。

大鼠；睪丸缺血再灌注損傷；缺血后處理；睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位

睪丸扭轉(zhuǎn)又稱(chēng)精索扭轉(zhuǎn)，是指精索沿其縱軸旋轉(zhuǎn)，精索內(nèi)血管受壓阻塞，導(dǎo)致睪丸缺血甚至梗死。25歲以下男性發(fā)病率為1/4000，因此該病并非少見(jiàn)[1]。復(fù)位是治療睪丸扭轉(zhuǎn)的主要方法，可以恢復(fù)睪丸血液供應(yīng)，避免發(fā)生梗死。但是睪丸復(fù)位后往往出現(xiàn)萎縮，生精功能障礙[2]。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷是一個(gè)典型的缺血再灌注損傷。本研究建立大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型，探討缺血后處理對(duì)大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 成年雄性SD大鼠（250～300g）60只（上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2012－0002。

1.2 試 劑 丙二醛試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，聚乙二醇辛基苯基醚、氯化鈉﹑伊紅和疊氮鈉購(gòu)自Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型建立及其處理采用隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法將60只成年雄性SD大鼠分為對(duì)照組、缺血再灌注組和缺血后處理組，每組20只。將氯胺酮（50mg/kg）注入大鼠腹腔內(nèi)麻醉。所有手術(shù)在無(wú)菌條件下施行。在大鼠左側(cè)髂腹股溝做一切口，施行以下手術(shù)。對(duì)照組：通過(guò)此切口取出左側(cè)睪丸，用11/0無(wú)創(chuàng)傷縫線穿過(guò)睪丸白膜。然后通過(guò)原切口放睪丸入陰囊內(nèi)，縫合切口。缺血再灌注組：通過(guò)同樣的切口取出左側(cè)睪丸，將睪丸繞精索逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)720度，在睪丸白膜與陰囊之間用11/0無(wú)創(chuàng)傷縫線縫合固定，保持睪丸缺血狀態(tài)。2h后，拆除縫線，將睪丸反方向旋轉(zhuǎn)720度復(fù)位，睪丸恢復(fù)血液供應(yīng)，依舊存活，放睪丸入陰囊內(nèi)，縫合切口。缺血后處理組：通過(guò)同樣的手術(shù)方式造成睪丸缺血，2h后行缺血后處理，即先將睪丸復(fù)位，血流再灌注10s，然后將睪丸再次旋轉(zhuǎn)720度，使睪丸缺血10s，反復(fù)6個(gè)循環(huán)。最后睪丸復(fù)位，血流持續(xù)灌注。復(fù)位后4h，每組處死大鼠10只，行左側(cè)睪丸切除術(shù)，測(cè)量丙二醛水平。復(fù)位后3個(gè)月，處死剩余大鼠，行左側(cè)睪丸切除術(shù)，分析睪丸生精功能。

2.2 睪丸組織丙二醛水平測(cè)定 將睪丸組織在1.5%氯化鉀溶液中攪勻，制成10%組織勻漿。用硫代巴比妥酸法測(cè)定睪丸組織中丙二醛水平。

2.3 睪丸生精功能分析 通過(guò)檢測(cè)睪丸重量和每日精子產(chǎn)量評(píng)估睪丸生精功能。左側(cè)睪丸切下后稱(chēng)重，然后在50mL溶液（含0.5%聚乙二醇辛基苯基醚、0.154M氯化鈉﹑伊紅溶液和2%疊氮鈉）中攪勻。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)量精子細(xì)胞核數(shù)目，其結(jié)果作為每日精子產(chǎn)量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 三組大鼠睪丸丙二醛水平比較 相比于對(duì)照組，缺血再灌注組睪丸的丙二醛水平顯著升高（P＜0.05）；缺血后處理組睪丸的丙二醛水平明顯低于缺血再灌注組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

3.2 三組大鼠睪丸生精功能比較 缺血再灌注組睪丸的重量和每日精子產(chǎn)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；缺血后處理組睪丸的上述指標(biāo)顯著高于缺血再灌注組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠睪丸組織丙二醛水平﹑睪丸重量及每日精子產(chǎn)量比較（±s）

表1 三組大鼠睪丸組織丙二醛水平﹑睪丸重量及每日精子產(chǎn)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05

組別對(duì)照組缺血再灌注組缺血后處理組只數(shù)10 10 10丙二醛水平（nmol/mg）1.45±0.20 2.73±0.34* 1.86±0.29#睪丸重量（g）1.95±0.11 1.10±0.15* 1.62±0.18#每日精子產(chǎn)量（×106/g）22.03±1.97 2.14±0.42* 15.13±1.81#

4 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是一個(gè)缺血再灌注過(guò)程，在這一過(guò)程中，產(chǎn)生了過(guò)量的活性氧，如超氧陰離子、過(guò)氧化氫等[3]?；钚匝醍a(chǎn)生機(jī)制：缺血時(shí)，ATP生成減少，導(dǎo)致膜泵功能障礙，大量鈣離子進(jìn)入中性粒細(xì)胞內(nèi)，引起NADPH氧化酶活性增加；再灌注時(shí)，大量的氧隨血液進(jìn)入缺血組織，NADPH氧化酶將氧轉(zhuǎn)化為超氧陰離子、過(guò)氧化氫等活性氧[4]?；钚匝鹾茈y直接定量，因?yàn)榘胨テ诤芏?。丙二醛是活性氧引起?xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的穩(wěn)定末端產(chǎn)物，通常被作為活性氧的標(biāo)志[3]。本研究顯示，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起睪丸內(nèi)丙二醛水平顯著升高，說(shuō)明睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，產(chǎn)生了過(guò)量的活性氧。此外，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，生精功能也嚴(yán)重受損，包括睪丸重量減輕和每日精子產(chǎn)量下降?；钚匝跄苎趸?xì)胞脂質(zhì)、蛋白和DNA,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，甚至死亡[5]。已有研究證實(shí)，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，活性氧的過(guò)量產(chǎn)生是引起生精功能損傷的主要原因[3]。因此，減少活性氧的過(guò)量產(chǎn)生有利于保護(hù)睪丸生精功能。

據(jù)報(bào)道，再灌注起始階段，睪丸﹑心肌﹑腎臟﹑腸等臟器的血液灌注量要高于缺血前，被稱(chēng)之為過(guò)度灌注[6]。過(guò)度灌注導(dǎo)致大量氧進(jìn)入缺血組織內(nèi)，引起活性氧過(guò)量產(chǎn)生，造成組織損傷[7]。針對(duì)這一現(xiàn)象，缺血后處理可以減少缺血臟器在起始階段的血液灌注量，降低活性氧產(chǎn)生，從而減輕臟器的缺血再灌注損傷。在犬的心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用此法，成功地減輕了心肌的損傷[6]。其他研究者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該方法也能減輕肝﹑腎﹑腦等臟器的缺血再灌注損傷[8]。因此，我們嘗試使用該方法治療大鼠睪丸缺血再灌注損傷。結(jié)果顯示，缺血后處理可明顯降低睪丸內(nèi)的丙二醛水平，提高了睪丸重量和每日精子產(chǎn)量。這表明缺血后處理減少了活性氧產(chǎn)生，保護(hù)了睪丸生精功能。

［1］Uyeturk U，Terzi EH，Gucuk A，et al.Prevention of torsioninduced testicular injury by Rhodiola rosea［J］.Urology，2013，82（1）：254.

［2］Cayan S，Saylam B，Tiftik N，et al.Rho-kinase levels in testicular ischemia-reperfusion injury and effects of its inhibitor，Y-27632，on oxidative stress，spermatogenesis，and apoptosis［J］.Urology，2014，83（3）：675.

［3］Bilommi R，Nawas BA，Kusmayadi DD，et al.The effects of glutathione on malondialdehyde expression and seminiferous tubule damage in experimental testicular torsion-detorsion in Wistar rats［J］.J Pediatr Urol，2013，9（6 Pt B）：1059-1063.

［4］Parlaktas BS，Atilgan D，Ozyurt H，et al.The biochemical effects of ischemia-reperfusion injury in the ipsilateral and contralateral testes of rats and the protective role of melatonin［J］.Asian J Androl，2014，16（2）：314-318.

［5］Ozturk H，Ozturk H，Terzi EH，et al.Interleukin 10 reduces testicular damage in experimental testicular ischemia/reperfusion injury［J］.Urology，2014，83（2）：508.

［6］Ozkisacik S，Erdem AO，Durmaz O，et al.The long-term protective effects of short-interval postconditioning in testicular ischemia-reperfusion injury in rats［J］.J Pediatr Surg，2012，47（4）：743-746.

［7］Gozen A，Demiryurek S，Taskin A，et al.Protective activity of ischemic preconditioning on rat testicular ischemia：effects of Y-27632 and 5-hydroxydecanoic acid［J］.J Pediatr Surg，2013，48（7）：1565-1572.

［8］Minutoli L，Irrera N，Squadrito F，et al.Effects of ischaemic post-conditioning on the early and late testicular damage after experimental testis ischaemia-reperfusion［J］.Andrology，2014，2（1）：76-82.

（收稿：2014-09-07 修回：2014-09-14）

Effect of Ischemic Post-Conditioning on Testicular Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

CHEN Biyao,LIBin,WEI Siming,WANG Li. Department of Clinical Medicine,Zhejiang Medical College,Hangzhou(310053), China

Objective To investigate the effect of ischemic post－conditioning on testicular ischemia－reperfusion (IR)injury in rats.Methods Sixty adult male Sprague－Dawley rats were randomly divided into three groups:control group,IR group,and ischemic post－conditioning group,with 20 rats in each group.Control group underwent a sham operation on the left testis.In IR group,the left testis was rotated 720°for 2h,then detorsion was performed.In ischemic post－conditioning group,the left testis was rotated 720°for 2h,then ischemic post－conditioning was performed.First,testicular detorsion was done for 10－second blood flow reperfusion.Then,the left testis was rotated 720°again for 10－second ischemia.Such procedures were repeated 6 times.Lastly,testicular detorsion was performed for persistent blood flow reperfusion.One half of the rats in each group were sacrificed at 4h after detorsion,and left orchiectomy was done for measurement of malondialdehyde level.The remainder were killed at 3 months after detorsion,and left orchiectomy was performed for analysis of testicular spermatogenesis.Results Testicular torsion－detorsion caused a significant increase in the malondialdehyde level in the testes（2.73±0.34 vs 1.45± 0.20mmol/mg,P＜0.05）and a significant decrease in testicular spermatogenesis[（2.14±0.42）×106vs（22.03±1.97）× 106,P＜0.05].Ischemic post－conditioning significantly decreased malondialdehyde level in testes（1.86±0.29 vs 2.73± 0.34mmol/mg,P＜0.05）,and improved testicular spermatogenesis[（15.13±1.81）×106vs（2.14±0.42）×106,P＜0.05].Conclusion Ischemic post－conditioning has a protective effect on testicular ischemia－reperfusion injury.The effect is related to reduction in production of reactive oxygen species in testes.

rats；testicular ischemia－reperfusion injury；ischemic post－conditioning；testicular torsion－detorsion

浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系（杭州 310053）

韋思明，Tel：15268133671；E－mail：wsm1971@hotmail.com