劉 璐，劉祥梅，譚 軍，施 孟

(湖南師范大學體育學院，湖南長沙410012)

運動訓練機體常常產生疲勞，運用合理的營養(yǎng)手段抵抗疲勞、提高運動能力并研究其作用機制具有重要的運動營養(yǎng)學意義。韭菜子具有溫腎助陽和固精等功效［1］。山楂是我國特有的栽培果樹，山楂果實含有豐富的對人體有益成分，其中Vitamin C含量最為突出，鐵、鈣、果膠及黃酮類物質含量居各種鮮果之首［2］。據研究報道，山楂有消食、化積、健胃等藥用價值和具有較高的抗氧化性［3］。泥鰍是人們常食和方便食用的魚類，含有多種生物活性物質，如糖蛋白、凝集素、抗菌肽、不飽和多烯脂肪酸、牛磺酸和賴氨酸等必需氨基酸以及鋅硒等微量營養(yǎng)元素［4，5］。有實驗證明復方泥鰍超微粉膠囊(由凍干泥鰍、枸杞子、太子參、黃精、百合、桑葚共6種原料組成)具有顯著的抗疲勞功效［6］。研究資料表明，不同負荷運動對心肌MHC和TM1蛋白表達造成影響［7］，而中藥和食物干預下的變化少有研究報道。根據中醫(yī)“藥食同源”理論，本實驗選取韭菜子、山楂和泥鰍配制成韭楂泥鰍湯干預小鼠游泳訓練，觀察小鼠力竭運動能力和心肌MHC和TM1基因表達變化，對中醫(yī)藥食功能性食品抗疲勞及提高運動能力作用和機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性ICR小鼠，體重20±2g，購自湖南斯耐克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2011-0003。以國家標準嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。室溫控制在22±2℃，相對濕度40%-55%，每天光照12 h。小鼠靜養(yǎng)與觀察三日，按體重分層隨機分為安靜對照組(C)、運動訓練組(T)、泥鰍運動組1(N1)、泥鰍運動組2(N2)，每組8只。

1.2 韭楂泥鰍湯制備

韭菜子與山楂等量，加6倍自來水浸泡一晚，旺火加熱至沸騰后文火煎煮40 min，濾出煎液后殘渣再加入4倍量自來水文火煎煮40 min濾出煎液。將2次煎液過濾去渣合并，放入4℃冰箱備用。韭菜子、山楂、泥鰍肉末按1∶1∶5重量比，用燒杯煎煮并在碾砵內碾成均勻汁液，濃度為0.5 g/ml，供N1組直接灌胃。按純凈水與泥鰍汁液3∶2(V/V)配成0.2 g/ml的濃度，用于N2組灌胃。

1.3 游泳訓練與力竭

將T和N組小鼠放入深80 cm、直徑55 cm桶內游泳，水溫30±2℃、水深40 cm，計時并注意觀察狀態(tài)。每周五天，下午進行，共進行三周。第一周不負重30 min，第二周尾根部2%負重40 min，第三周3%負重40 min。第二和三周每日上午，C組和T組生理鹽水灌胃，N1和N2組灌韭楂泥鰍湯，按0.3 ml/只灌胃。訓練結束休息2 d，T組和N組在尾根部負重5%進行力竭游泳，記錄游泳至力竭時間。力竭判斷標準:小鼠沉入水中超過10 s，且放在平面時呼吸深、急，神情疲倦，垂頭俯臥，刺激后無反應，無法完成翻正反射。

1.4 取材

T組和N1組小鼠力竭游泳24 h后，與C組均稱取體重和麻醉，在冰上打開胸腔，迅速摘取心臟，放入預冷的生理鹽水中清洗，濾紙小心吸干水分，稱取心臟質量。用小剪刀剪取心尖，置液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩男募馍戏阶笮氖仪腥?×3×3 mm心肌組織置入4℃的4%多聚甲醛中，固定1周后進行常規(guī)組織脫水、透明、包埋、石蠟切片，片厚5 μm。

1.5 檢測指標及方法

1)心系數 以小鼠心臟質量與體質量的比值計算心臟的臟器系數(mg/g)。

2)心肌組織HE染色 心肌組織切片在常規(guī)脫蠟水化后進行HE染色，胞核染成藍色，胞質染成紅色，光鏡下觀察組織細胞的結構。使用LEICADM IJBZ型雙目顯微鏡(德國LEICA公司)和MoticB顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團公司)，由湖南中醫(yī)藥大學病理室完成。

3)Real-time PCR MHC和TM1基因表達的檢測由湖南師范大學生命科學院分子生物學實驗室完成。

引物合成:α-MHC基因引物序列:For:ACGGTGACCATAAAGGAGGA; Rev: TGTCCTCGATCTTGTCGAAC。β-MHC基因引物序列:For:ATGTGCCGGACCTTGGAAG;Rev:CCTCGGGTTAGCTGAGAGATCA。TM1基因引物序列:FOR:TGACGAACAACTTGAAGTCACTG;Rev:CAGGGCCAGCTTTAGCTCGTTA。

總RNA的提取:按照trizol reagen(美國Invitrogen產品)試劑說明書進行。將0.1 g組織加到1 ml TRIzol中，用組織勻漿機勻漿，吹打混勻后在室溫培養(yǎng)10 min，加入0.25 ml氯仿渦旋振蕩15 s，在室溫靜置5 min。4℃、12000 g，離心15 min至分層，吸取上層水相加入等體積100%異丙醇輕輕混勻。-20℃放2 h或過夜，4℃、12000 g，離心10 min形成凝膠狀RNA沉淀。吸掉上清后加入1 ml的75%乙醇，4℃、7500 g，離心5 min，吸掉上清后在空氣中放5～15 min干燥沉淀，加入30 ul無RNase水，用槍頭混勻沉淀。測定RNA濃度并調整為0.4 ug/ul，每個取3 ul上樣跑膠(1.5%的DNA膠)，觀察RNA完整性。

mRNA逆轉錄:在編號1-6的1.5 ml EP管中加入下列組份試劑(消化基因組DNA):RNA(1 ug)2.5 ul，10 × buffer with MgCl 1ul，DNaseI(fermentas)1ul，Nuclease-free water 5.5 ul，合計 10 ul。37 ℃ 下，30 min后加入25 mM的EDTA 1ul，65℃，10 min終止反應。在上述反應體系中，加反應試劑RNA(1 ug)11 ul，Primer oligo(dT)1 ul。再按下加入試劑5×reaction buffer 4 ul，Ribolock RNase Inhibitor(20 U/ul)1 ul，10 ×dNTP Mix(10 mM each)2 ul和 RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200 u/ul)1 ul。42 ℃反應60 min，70℃熱處理5 min，加水稀釋至100 ul。

Real time PCR:儀器為ABI 7900HT;試劑:SYBR? Premix Ex TaqTM(Takara);體系:

SYBR ? Premix Ex Taq(2 ×)15 μl，PCR Forward Primer(10μM)1.0 μl，PCR Reverse Primer(10μM)1.0 μl，ROX 0.6 μl，Template 5 μl，ddH2O 為 7.4 μl，總體系 30 ul，分三重復孔，每孔10 ul。程序:95°C30sec，95°C5sec，60°C30sec，40 個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗數據以平均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 19統(tǒng)計軟件進行分析，樣本均數的比較采用One-Way ANOVA分析，方差齊用LSD、方差不齊采用Dennett's T3法分析比較。顯著性水平取α=0.05。

2 結果

2.1 小鼠力竭運動時間

N1組小鼠的游泳至力竭的時間為129.57±36.23 min，顯著地長于T組的55.86±20.23 min，時間延長131.95%(P＜0.05)。N2組為89.57±20.23 min，呈長于T組趨勢但不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，未對N2組進行后續(xù)取材觀察與檢測。

2.2 小鼠心系數

與C組小鼠心系數3.62±0.36比較，T組小鼠的心系數4.99±0.67顯著增高(P＜0.05)，N1組心系數4.21±0.50有增高趨勢，但無顯著統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.3 小鼠心肌組織HE染色結果

圖1示，C組心肌細胞界限清晰，結構正常。力竭后24h，T組的心肌細胞界限模糊，可見心肌纖維斷裂和間質水腫;N1組的心肌細胞界限清晰，排列整齊，無心肌纖維斷裂，也無明顯的間質水腫。

2.4 小鼠心肌MHC mRNA及TM1 mRNA的表達

表1、圖2示，與C組比較，T組的α-MHC mRNA和TM1 mRNA表達無顯著性差異(P＞0.05)，而β-MHC mRNA表達顯著增高(P＜0.05)，α/β-MHC mRNA顯著降低(P＜0.05);N1組的α-MHC mRNA、β-MHC mRNA和TM1 mRNA表達較C組和T組均顯著增高(P＜0.05)，但α/β-MHC mRNA卻無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 各組小鼠心肌形態(tài)學變化(蘇木精-伊紅染色，×200)

3 討論

3.1 韭楂泥鰍湯對小鼠運動能力的影響

“運動性疲勞”是機體生理過程不能維持其機能在特定水平上和(或)不能維持預定的運動強度，導致機體運動能力暫時性下降［8］。中醫(yī)認為這與機體出現(xiàn)陰精和陽氣不足，缺乏維持正常運轉的物質和動力有關，補腎益精壯陽能抵抗疲勞達到提高運動能力的效果［1］。本實驗選取韭菜子溫腎助陽固精，山楂健胃消食和泥鰍補中氣、滋陰壯陽、強精壯體，配制成補腎益精壯陽的韭楂泥鰍湯干預小鼠力竭游泳運動探討其對小鼠運動能力的影響。實驗結果證實合理應用能使訓練小鼠游泳至力竭的時間比單純運動訓練小鼠延長，對補益機體、抵抗疲勞、提高運動能力有良好作用。

表1 各組小鼠心肌α-MHC mRNA、β-MHC mRNA、α/β-MHC mRNA和TM1 mRNA表達(RQ值，±S)

表1 各組小鼠心肌α-MHC mRNA、β-MHC mRNA、α/β-MHC mRNA和TM1 mRNA表達(RQ值，±S)

* 與C組比較，P＜0.05;＆:與T組比較，P＜0.05。

組別 n α-MHC mRNA β-MHC mRNA α/β 1.64±0.84 1.00±0.17 1.74±1.08 1.36±0.32 T組 8 1.33±0.49 2.28±0.51* 0.60±0.23* 1.69±0.13 N1組 8 6.20±3.74*＆ 4.05±0.71*＆ 1.49±0.29 4.42±0.5*＆-MHC mRNA TM1 mRNA C組8

圖2 小鼠心肌組織MHC mRNA及TM1 mRNA差異表達的柱狀圖

3.2 韭楂泥鰍湯對訓練力竭小鼠心肌形態(tài)學影響

生理性心肌肥大與病理性心肌肥大均可表現(xiàn)為心系數的增加［9］，單純將心系數指標作為心臟功能提高的標志會混淆兩種不同性質的心肌肥大，耐力運動后的心系數應與形態(tài)學以及心臟標志物等指標結合起來共同分析鑒別［10］。本實驗將心系數指標與HE染色觀察相結合顯示，單純運動訓練并力竭游泳小鼠的心系數明顯增高，心肌細胞界限模糊，心肌纖維斷裂和間質水腫，細胞形態(tài)改變，可見心肌組織和細胞有一定程度的結構損傷。眾所周知，力竭運動造成心肌損傷，由于心臟是血液循環(huán)的動力器官，能量消耗大，心肌幾乎完全依靠有氧代謝提供能量，對缺血缺氧十分敏感［11］。有學者認為心肌損傷有可能導致心肌線粒體數量減少和某些心肌收縮蛋白質出現(xiàn)降解［12］，心肌的收縮能力及運動能力勢必受到影響。而應用韭楂泥鰍湯干預的小鼠心系數呈增高趨勢，力竭運動后心肌細胞光鏡下纖維結構清晰，著色均勻，細胞界限清楚，細胞核染色清晰，顯然力竭運動對心臟造成的損害減輕。反映合適濃度的韭楂泥鰍湯干預，可使小鼠在運動過程中保持良好的心肌供血供氧，機體對運動訓練適應良好。其心系數適度增高是心臟形態(tài)結構優(yōu)化、訓練小鼠運動耐力提高、運動能力上升的結構基礎。

3.3 各組小鼠心肌組織MHC基因表達

心肌肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)基因編碼的重型肌球蛋白有α-MHC(α-myosin heavy chain)和 β -MHC(β -myosin heavy chain)，研究表明α-MHC/β-MHC是決定心臟收縮速度和收縮力的關鍵因素［13］。α-MHC mRNA 表達和 α/β-MHC mRNA值顯著性上調，可能通過調節(jié)重型肌球蛋白提高心肌收縮力［14］。α-MHC是具有ATP酶活性的重要結構蛋白和收縮蛋白，心肌α-MHC是心肌重塑過程中的重要標志蛋白質［15］，運動引起心肌肥大的發(fā)生時心肌細胞α-MHC增加，而β-MHC減少［16］。在力竭運動和遞增負荷大強度運動后，α-MHC表達下調，預示著心肌收縮能力下降，這可能是大鼠心肌組織在力竭運動及大強度運動刺激下發(fā)生缺血性損傷所致［17］。李曉東等的實驗表明心肌缺血缺氧條件下，β-MHC的表達可增加［18］。本實驗中單純訓練并力竭游泳小鼠的心肌組織中α-MHC mRNA下調、β-MHC mRNA表達上升和α/β-MHC mRNA值降低，可能導致α-MHC蛋白降低，影響心肌收縮能力。結合其心系數增加和HE染色結果，說明心肌確實存在一定損害，有可能發(fā)生了心肌缺血損傷后病理性肥大。而合適濃度的韭楂泥鰍湯干預，小鼠心肌α-MHC mRNA表達明顯升高，α/β-MHC mRNA接近正常，說明超負荷運動后機體心臟在基因水平上也發(fā)生適應運動負荷的良性變化，有利于迅速恢復強健的心肌收縮能力。結合其適度增高的心系數和HE染色光鏡下的結果，說明韭楂泥鰍湯干預小鼠的心肌重塑呈良性。

3.4 各組小鼠心肌組織TM1基因表達

原肌球蛋白(tropomyosin，TM)是肌肉收縮過程中重要的調節(jié)蛋白質［19］。原肌球蛋白1(Tropomyosin-1，TM1)是TM家族中相對分子質量高，對肌肉收縮過程具有重要調節(jié)作用的成員，其最重要的特性是能與肌動蛋白肌絲相結合，在細胞移動、形態(tài)發(fā)生和胞漿移動中調節(jié)肌動蛋白絲的動態(tài)變化，使肌動蛋白穩(wěn)定于聚合狀態(tài)［20］。目前，對TM1的研究多見于臨床，在運動醫(yī)學領域史紹蓉報道其與肌球蛋白重鏈對運動應激的敏感性高，并與運動負荷密切相關，力竭運動和遞增負荷大強度運動對心肌收縮功能負面影響，中等強度運動未產生不良影響或起促進作用［21］。本實驗結果顯示，單純訓練并力竭游泳小鼠心肌的TM1 mRNA表達有上升趨勢，說明適度的運動訓練可以通過基因表達改善，促進心肌收縮調節(jié)蛋白形成，提高心肌收縮能力以適應運動負荷，并在一定程度上對抗力竭運動造成的負面影響。但應用韭楂泥鰍湯干預，小鼠心肌TM1 mRNA表達明顯高于安靜組與單純訓練并力竭游泳組，有可能TM1的調節(jié)作用更充分，從而心肌收縮能力增強，功能狀態(tài)更佳。說明此湯通過基因表達變化而影響心肌收縮蛋白和收縮調節(jié)蛋白形成，是提高小鼠運動能力的重要分子生物學機制。

4 結論

韭楂泥鰍湯能抵抗運動疲勞，延長游泳訓練小鼠的力竭運動時間，其作用機制與有效優(yōu)化訓練小鼠心臟形態(tài)結構、穩(wěn)定肌球蛋白重鏈基因表達比和增強對肌肉收縮過程中具有重要調節(jié)作用的原肌球蛋白1的基因表達相關。

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