田麗麗 丁北川 祝秉東 王甦民

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·綜述·

結(jié)核分枝桿菌基因分型方法及其應(yīng)用

田麗麗 丁北川 祝秉東 王甦民

結(jié)核分枝桿菌基因分型是監(jiān)測(cè)結(jié)核病流行和傳播的有效手段.用于結(jié)核病流行病學(xué)研究的分型方法已有很多種，但不同的基因分型方法各有特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)不同的研究目的選擇合適的方法，或者多種方法結(jié)合使用，并結(jié)合傳統(tǒng)的流行病學(xué)資料綜合分析可得出可靠結(jié)論。結(jié)核分枝桿菌分型鑒定技術(shù)在研究結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥和耐多藥檢測(cè)，以及結(jié)核病的病原演變、跟蹤和確定傳染源、確定流行病學(xué)事件、揭示疾病傳播機(jī)制等方面發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，此類(lèi)研究正與新興的遺傳信息學(xué)相結(jié)合，相應(yīng)成果能夠?yàn)楦茖W(xué)地制定結(jié)核病防控策略提供依據(jù)。

結(jié)核分枝桿菌； 基因分型技術(shù)

隨著結(jié)核病預(yù)防和治療研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)細(xì)胞水平時(shí)代結(jié)核病流行病學(xué)存在的兩大問(wèn)題——對(duì)傳播途徑和傳染源的了解均不夠確切、不夠深刻。非核酸法的傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)分型方法，是建立在細(xì)菌表型特征基礎(chǔ)上認(rèn)識(shí)細(xì)菌，包括對(duì)抗結(jié)核藥物耐受性、生物酶活性分型法、血清分型法和噬菌體分型法等。表型特征惟一“有效”的菌株鑒定方法是噬菌體分型法，但是此方法耗時(shí)久，操作繁瑣，重復(fù)性差，并且噬菌體種類(lèi)有限，其分辨力較低。而Mtb耐藥性監(jiān)測(cè)作為流行病學(xué)調(diào)查方式之一，只能了解其耐藥的表型狀況，難以探討其內(nèi)在機(jī)制。對(duì)絕大多數(shù)Mtb來(lái)說(shuō)，鑒于同一菌種菌株間具有高度同源性，通過(guò)表型差異無(wú)法區(qū)分，因此通過(guò)生物表型結(jié)果而對(duì)Mtb菌株進(jìn)行分型無(wú)法得到廣泛應(yīng)用[1]。

隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，1990年以后逐步建立了一些根據(jù)核酸序列進(jìn)行菌株鑒定的高度特異的基因分型方法，主要包括：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、DNA指紋圖譜分析，以及以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因分型方法，等等。相應(yīng)方法結(jié)合現(xiàn)代分子生物信息學(xué)技術(shù)，使Mtb菌株分型進(jìn)入了一個(gè)全新的領(lǐng)域——單株水平的鑒定。菌株分型結(jié)果結(jié)合病例流行病學(xué)資料，以闡明結(jié)核病的傳播流行問(wèn)題，形成了結(jié)核病分子流行病學(xué)。結(jié)核病分子流行病學(xué)的建立和廣泛應(yīng)用使我們對(duì)結(jié)核病的傳播規(guī)律和特點(diǎn)有了新的認(rèn)識(shí),解決了許多傳統(tǒng)流行病學(xué)方法難以解決的問(wèn)題。結(jié)核病分子流行病學(xué)研究始于1984年，20世紀(jì)90年代在全球開(kāi)展，迄今為止國(guó)內(nèi)、外有很多這方面的報(bào)道[2-10]。核酸分型技術(shù)是結(jié)核病分子流行病學(xué)研究的重要手段之一，特別是在追蹤和確定傳染源方面起重要作用。筆者對(duì)近年來(lái)Mtb的基因分型方法研究進(jìn)展作一綜述。

一、常用Mtb基因分型方法

(一)Mtb標(biāo)準(zhǔn)分型方法

插入序列(insertion sequence，IS)是可移動(dòng)的基因元件，通常小于2.5 kb，它在基因組內(nèi)可發(fā)生轉(zhuǎn)位、重復(fù)或缺失。IS6110插入序列發(fā)現(xiàn)于1989年[11]，1S6110由1355個(gè)堿基對(duì)組成，并且是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)特有的插入序列。1990年Thierry等最先描述了IS6110，其全長(zhǎng)1355 bp，其上有PvuII、BamHI等酶切位點(diǎn)，末端含有不完整的28 bp反向重復(fù)序列，是插入序列IS3家族的一個(gè)成員，完整的序列特異地存在于MTBC中。目前，對(duì)Mtb來(lái)說(shuō)，已知的IS6110拷貝數(shù)從0～25不等，M.bovis有1～3個(gè)拷貝，BCG含單一拷貝；而非結(jié)核分枝桿菌尚未發(fā)現(xiàn)IS6110拷貝。Mtb不同菌株間，IS6110在基因組中的位置也不同。因此，IS6110-RFLP就是通過(guò)檢測(cè)IS6110數(shù)目與在基因組中位置的不同來(lái)區(qū)分不同的菌株[12-14]。1993年，van Embden等[12]提出了以IS6110為基礎(chǔ)的DNA印跡雜交的標(biāo)準(zhǔn)化操作方法，即IS6110-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)(IS6110-RFLP)分型法。同時(shí)推薦IS6110-RFLP分型作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群標(biāo)準(zhǔn)分型方法。該分型技術(shù)是在提取結(jié)核分枝桿菌DNA后，用PvuII限制性?xún)?nèi)切酶消化，酶切片段在瓊脂糖凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移并固定到膜上，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IS6110探針和分子量標(biāo)準(zhǔn)探針與膜上DNA片段雜交，然后進(jìn)行顯影[15]。不同菌株的分型結(jié)果用Bionumerie軟件進(jìn)行分析。由于使用的限制性?xún)?nèi)切酶PvuII在IS6110上僅有一個(gè)PvuII酶切位點(diǎn)，對(duì)IS6110序列僅切割1次。

雖然IS6110-RFLP分型方法被推薦為金標(biāo)準(zhǔn)，但仍然存在一些不足之處，首先是需要的菌量大，待測(cè)Mtb的DNA量需達(dá)到4500 ng；其次是實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作復(fù)雜，較為繁瑣，需進(jìn)行Southern雜交；再者需要特殊軟件進(jìn)行分析；同時(shí)，為了進(jìn)行分型結(jié)果的室間比對(duì)，每批實(shí)驗(yàn)均需要使用標(biāo)準(zhǔn)菌株和內(nèi)參核酸標(biāo)志物；另外，對(duì)IS6110拷貝數(shù)少或無(wú)IS6110拷貝數(shù)的菌株難以進(jìn)行Mtb菌株水平的鑒定。

針對(duì)IS6110標(biāo)準(zhǔn)方法存在的缺陷，在此基礎(chǔ)上人們又逐步研制出一些新的插入序列或重復(fù)序列作為分型標(biāo)志，起到了補(bǔ)充作用[16]。如牛型結(jié)核分枝桿菌中的新的插入序列IS1081；另外還有用于低拷貝Mtb分型方法，如多態(tài)性富含GC的重復(fù)序列(PGRs)等。

(二)基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的分型方法

與經(jīng)典IS6110-RFLP比較，基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的分型方法，如PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分型方法、單核苷酸多態(tài)性分型、間隔區(qū)寡核苷酸分型法、可變串聯(lián)重復(fù)序列分型方法、靶向缺失區(qū)多重PCR等方法，用于鑒定“北京家族”基因型等，具有所需菌量少、直接使用涂陽(yáng)標(biāo)本、速度快、使用設(shè)備簡(jiǎn)單、結(jié)果易數(shù)字化、易實(shí)現(xiàn)全球數(shù)據(jù)庫(kù)共享等優(yōu)勢(shì)。

1. PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分型方法：PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism, SSCP)是一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈DNA凝膠電泳技術(shù)[17]，將PCR產(chǎn)物變性后裂解為兩條互補(bǔ)的單鏈DNA，長(zhǎng)短不同及空間構(gòu)型各異的DNA片斷經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，由于其遷移率的差別在凝膠上呈現(xiàn)出不同的帶型，將其與野生型標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)照，即可區(qū)分野生型和突變型基因。該方法敏感度高、穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)單快速，而且用銀染色代替核素標(biāo)記或溴化乙錠(ethidium bromide, EB)染色，從而避免了放射性或強(qiáng)致突變?cè)噭┑奈廴竞屯{。廣泛用于基因突變和DNA多態(tài)性的檢測(cè)和篩查，該方法也可應(yīng)用于Mtb耐藥基因的檢測(cè)[18]。

2. 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)分型：該方法通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，Mtb基因組間存在DNA保守區(qū)，可利用此區(qū)域核苷酸水平的多態(tài)性不同，對(duì)菌株進(jìn)行區(qū)分。包括非同義SNP和同義SNP，非同義SNP可能是由于外部選擇性壓力，如抗結(jié)核藥物的作用，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，隨之細(xì)菌產(chǎn)生耐藥表型；而同義SNP并不引起氨基酸的改變，是研究Mtb基因漂移和進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)。SNP分析主要用于Mtb進(jìn)化研究、耐藥及細(xì)菌毒力分析。Sreevatsan等[19]研究了2個(gè)非同義SNP，即過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶編碼基因katG的463位密碼子和DNA回旋酶A亞單位編碼基因gyrA，并據(jù)此把現(xiàn)代結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群劃分為3個(gè)主要基因組：PGG1、PGG2和PGG3。Gutacker等[20]進(jìn)一步用36個(gè)同義SNP將三組PGG細(xì)分為九大群(圖1)，這些研究為了解臨床菌株的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性，以及不同系統(tǒng)分支在人群中的分布特征提供了很大幫助。

圖1 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群同義單核苷酸多態(tài)(sSNPs)樹(shù)(引自文獻(xiàn)[20])

3. 間隔區(qū)寡核苷酸分型法(Spoligotyping)：該分型法是目前最常用的、基于PCR技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌快速基因分型方法。此方法是基于直接重復(fù)區(qū)(direct repeat，DR)的多態(tài)性。DR區(qū)包括10～50個(gè)直接重復(fù)序列，每個(gè)直接重復(fù)序列包含36個(gè)堿基對(duì)，直接重復(fù)序列被不同的大小在34～41 bp范圍內(nèi)的間隔區(qū)寡核苷酸序列分隔。任意2個(gè)直接重復(fù)序列間的寡核苷酸序列具有很高的保守性，由于不同Mtb菌株中間隔區(qū)的個(gè)數(shù)和序列不同，導(dǎo)致該區(qū)域多態(tài)性，以此作為基因分型的分子標(biāo)志[14]。因此，間隔區(qū)寡核苷酸序列可用于區(qū)分不同的Mtb，此方法稱(chēng)為Spoligotyping。該方法是通過(guò)擴(kuò)增間隔區(qū)，將帶有標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上結(jié)合的43個(gè)寡核苷酸探針雜交，再通過(guò)電化學(xué)發(fā)光(ECL)并用膠片曝光就可得到不同菌株間隔區(qū)圖譜。

與IS6110-RFLP比較，Spoligotyping有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 所需樣本DNA量少，不需要大量培養(yǎng)菌株；(2)能夠?qū)tb進(jìn)一步分型到亞種水平，特別是對(duì)IS6110低拷貝的菌株，具有較高的分辨力[21-22]；(3)結(jié)果易于分析，數(shù)字化結(jié)果有利于不同實(shí)驗(yàn)室間的比較及國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)的建立；(4)是鑒別Mtb“北京基因型”家族的金標(biāo)準(zhǔn)，特征圖譜為1～34個(gè)間隔區(qū)缺失。Spoligotyping結(jié)合IS6110分型法在紐約已成為常用的基因分型手段[23]。

4.可變串聯(lián)重復(fù)序列分型方法：近幾年，一種以PCR為基礎(chǔ)的新的分型方法，可變串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats，VNTR)分型方法被研究者分析介紹[24-29]。VNTR屬于小衛(wèi)星DNA，在Mtb中的分布表現(xiàn)出高度的個(gè)體特異性。每個(gè)特定的VNTR位點(diǎn)由兩部分組成，即中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)。該方法是基于識(shí)別H37Rv基因組的11個(gè)串聯(lián)重復(fù)區(qū)而建立的方法，針對(duì)這11個(gè)區(qū)設(shè)計(jì)引物并對(duì)不同DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物片段大小來(lái)決定每一區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)，重復(fù)序列的數(shù)目在不同菌株間具有多態(tài)性，因此可以通過(guò)比較VNTR位點(diǎn)的重復(fù)序列的數(shù)目來(lái)區(qū)分不同的菌株。VNTR分型方法的分辨力取決于所采用位點(diǎn)的分辨力，因此發(fā)現(xiàn)更多高分辨力位點(diǎn)可以提高其分辨力。

VNTR分型方法具備了基于核酸擴(kuò)增分型方法的優(yōu)勢(shì)以外，同時(shí)具有很高的可重復(fù)性，并能提供數(shù)字化的結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間具有非常好的可比性，可以同時(shí)對(duì)大量樣本進(jìn)行分析。其次，能對(duì)IS6110拷貝數(shù)較少的菌株進(jìn)行分型。

分枝桿菌散在分布的重復(fù)單位(Mycobacterial interspersed repeat units，MIRUs)是對(duì)VNTR分型方法進(jìn)一步改進(jìn)而形成。MIRU位點(diǎn)是在Mtb基因組中散在分布的41個(gè)重復(fù)序列，重復(fù)單位的大小在46～100 bp之間，其中12個(gè)MIRU位點(diǎn)(表1)具有多態(tài)性。MIRU分型方法根據(jù)不同菌株間12個(gè)區(qū)拷貝數(shù)的差異進(jìn)行基因型分型。該分型方法結(jié)果數(shù)字化，分析簡(jiǎn)單，也便于在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比較；其分辨力與IS6110-RFLP接近，且省時(shí)，被認(rèn)為有望替代IS6110-RFLP的新分型方法[30]。

可變串聯(lián)重復(fù)序列分型方法盡管具有其優(yōu)勢(shì)，但也存在不足之處，因?yàn)槊恳粋€(gè)遺傳標(biāo)志物僅反應(yīng)細(xì)菌基因組信息的甚少一部分，因此應(yīng)根據(jù)不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因多態(tài)性，選擇適合本地區(qū)的優(yōu)化VNTR位點(diǎn)進(jìn)行分型。

表1 MIRU位點(diǎn)引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物片斷長(zhǎng)度

5.靶向缺失區(qū)多重PCR(deletion-targeted multiplex PCR，DTM-PCR)方法鑒定“北京家族”基因型：近些年，“北京家族”Mtb在國(guó)內(nèi)外廣泛傳播[31-33]，引起研究者很大重視。 這些菌株傳播廣泛，且被認(rèn)為與Mtb的耐多藥(multi-drug resistance，MDR)有關(guān)[34]。Spoligotyping分型方法被認(rèn)為是鑒定“北京家族”的金標(biāo)準(zhǔn)[35-36]。但相對(duì)于單純PCR的分型方法來(lái)說(shuō)，這種方法費(fèi)用高、繁瑣。Tsolaki 等[37]報(bào)道，RD105可作為鑒定“北京家族”菌株非常有價(jià)值的分子標(biāo)志，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究[38]，通過(guò)對(duì)RD105缺失區(qū)的檢測(cè)技術(shù)來(lái)鑒定“北京家族”；與Spoligotyping相比，其敏感度與特異度均達(dá)到100%。筆者也曾對(duì)該方法進(jìn)行研究[39]，與其他分型方法結(jié)合使用，能提高對(duì)Mtb菌株的分辨力。該方法快速、簡(jiǎn)單、成本低，在普通條件實(shí)驗(yàn)時(shí)即可完成。因此此種基因分型鑒定方法值得推廣應(yīng)用，進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)“北京家族”的深入研究。

6. 基因芯片技術(shù)：基因芯片技術(shù)是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時(shí)代特征的重大科技進(jìn)展之一，是將已知核酸序列的DNA固定在某種載體上，然后與待測(cè)樣品中的DNA或RNA，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，再經(jīng)過(guò)特定計(jì)算機(jī)軟件處理，獲得待測(cè)樣品的大量相關(guān)基因信息。

基因芯片技術(shù)在Mtb快速鑒定方面的應(yīng)用研究一經(jīng)報(bào)道，立即引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[40-41]，成為21世紀(jì)分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，應(yīng)用于分枝桿菌的菌種鑒定和耐藥性檢測(cè)等方面。Gingeras等[40]利用Mtb的rpoB基因保守區(qū)705 bp特異核苷酸序列探針與基因芯片雜交，對(duì)10種121株分枝桿菌進(jìn)行基因分型與菌種鑒定。有學(xué)者通過(guò)DNA芯片對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和卡介苗的基因組進(jìn)行雜交試驗(yàn)比較，證實(shí)卡介苗缺失了Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv致病相關(guān)的區(qū)域。Troesch等[41]基于16SrRNA和rpoB基因序列，利用基因芯片技術(shù)鑒定出70株27種不同菌種的分枝桿菌臨床分離株和15株耐利福平菌株，結(jié)果正確地確定了27個(gè)種屬中的26個(gè)，而且檢測(cè)出了所有耐利福平的15株Mtb的rpoB突變基因。國(guó)內(nèi)學(xué)者也用基因芯片技術(shù)對(duì)耐藥、耐多藥Mtb進(jìn)行檢測(cè)，基因芯片掃描結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果基本一致[43-45]。

(三)全基因組測(cè)序

目前，隨著結(jié)核分枝桿菌H37Rv、CDC1551、H37Ra、F11和KZN1435等菌株全基因組測(cè)序工作的完成，以及新一代核酸測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展；全基因組測(cè)序所需時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本不斷降低，完成全基因組測(cè)序的微生物菌株越來(lái)越多，使得我們能夠從全基因組水平研究和分析不同菌株間的差異及其生物學(xué)意義[46-47]。Fleischmann等[46]完成了Mtb 的CDC1551株的全基因組測(cè)序工作，并結(jié)合已經(jīng)發(fā)布的H37Rv株全基因組序列數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)基因的SNP，以及包括PE和PPE基因家族在內(nèi)的一些基因家族，在全基因組水平有較高水平的同義和非同義SNP的發(fā)生。近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者[48-50]對(duì)Mtb全基因組測(cè)序結(jié)果有更加完善的詮釋?zhuān)粡V泛應(yīng)用于菌種鑒定、菌株分型、藥敏試驗(yàn)，以及進(jìn)化分析和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等多個(gè)方面。

二、Mtb基因分型方法的應(yīng)用

(一) 在Mtb傳播中的應(yīng)用

Mtb基因分型技術(shù)能夠區(qū)分不同的菌株并追蹤其傳播情況。分子流行病學(xué)研究結(jié)核病傳播的前提是假設(shè)有一定的“簇”菌株，還有不同基因型的 “獨(dú)特”菌株。簇菌株提示患者可能是被同一傳染源近期感染所致；而獨(dú)特菌株提示患者發(fā)病可能是由于內(nèi)源性復(fù)燃所致。因此，通過(guò)成簇率的高低能夠反映出Mtb的傳播情況[51]。但用簇來(lái)解釋近期傳播時(shí)，需要注意以下兩點(diǎn)[52]：一是基因分型結(jié)果需結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查資料，例如，在不同的地域，感染相同基因型菌株的結(jié)核病患者不一定是近期感染，而傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查資料提供這些患者是否有接觸史，有助于判斷是否存在近期傳播；二是做流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，要盡可能包括所有結(jié)核病患者，且延長(zhǎng)調(diào)查的時(shí)間段。運(yùn)用IS6110-RFLP基因分型技術(shù)及PCR為基礎(chǔ)的分型技術(shù)可鑒別傳播菌株，追蹤傳染源。

這些基因分型方法還可判斷結(jié)核病患者是由近期感染Mtb導(dǎo)致還是潛在Mtb的復(fù)燃，如果患者2次發(fā)病分離株的分型結(jié)果不同，那么患者末次發(fā)病可判斷為外源性再感染，應(yīng)尋找其傳染源；如果同一患者2次發(fā)病所收集的菌株均源于同一基因型，則說(shuō)明是內(nèi)源性復(fù)燃。因此，Mtb基因分型可以區(qū)分經(jīng)過(guò)治療痊愈的結(jié)核病患者再次患結(jié)核病是由于外源性再感染還是內(nèi)源性復(fù)燃，這對(duì)采取有效的治療措施有重要意義。

Mtb基因組測(cè)序可用來(lái)對(duì)從同一個(gè)感染鏈條、不同患者體內(nèi)分離的菌株進(jìn)行進(jìn)化分析，進(jìn)而對(duì)整個(gè)傳播鏈條進(jìn)行清楚的流行病學(xué)分析。Schurch等[53]對(duì)處于一個(gè)確認(rèn)的Mtb傳播和感染鏈條中的患者體內(nèi)分離的菌株，通過(guò)DNA測(cè)序分析及其他鑒定方法，確認(rèn)了包括4個(gè)SNP在內(nèi)的6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。

(二)在“北京家族”中的應(yīng)用

1990年初，耐多藥菌株在紐約引起結(jié)核病大暴發(fā)；1995年，van Soolingen等[35]對(duì)北京地區(qū)的Mtb臨床分離株進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，有相似IS6110-RFLP型別的菌株占到89%，Spoligotyping分型顯示為相同型別(缺失1～34間隔區(qū))；由于這些菌株親緣關(guān)系很近，又在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)，因此定義為“北京家族”菌株。研究者發(fā)現(xiàn)此與之前在紐約發(fā)現(xiàn)的多耐藥菌株屬于同一家族[54]。此后，“北京家族”菌株被發(fā)現(xiàn)在中國(guó)其他城市乃至世界各國(guó)都有不同程度的廣泛傳播[31-33]。Spoligotyping基因分型方法目前主要用于“北京家族”的鑒定，RD105區(qū)缺失的定向缺失多重酶鏈聚合反應(yīng)技術(shù)(DTM-PCR)的分型方法也受到研究者很大的重視[37]，還有學(xué)者已經(jīng)做了相關(guān)工作，證實(shí)了此方法的可行性[38]。

(三)用于了解和推斷Mtb在傳播過(guò)程中的進(jìn)化狀況

結(jié)核病是最古老的疾病之一，埃及曾發(fā)現(xiàn)過(guò)感染結(jié)核病的木乃伊，湖南長(zhǎng)沙馬王堆漢墓發(fā)掘出的2000多年前女尸左肺上部、左肺門(mén)有鈣化灶，因此說(shuō)明結(jié)核病是一種古老疾病，但一直缺乏有力的流行病學(xué)證據(jù)。近些年，國(guó)外專(zhuān)家對(duì)木乃伊和骨骼中的分枝桿菌DNA進(jìn)行檢測(cè)，由于DNA殘存非常少，阻礙了分子學(xué)詳細(xì)的檢測(cè)，因此，對(duì)于古代結(jié)核病的研究報(bào)告較少[55]。Mtb全基因組測(cè)序完成，以及Mtb比較基因組研究的完善，為結(jié)核病流行病學(xué)研究提供了更有力的分子標(biāo)記物，進(jìn)而為研究結(jié)核病及其病原起源和進(jìn)化提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。國(guó)外學(xué)者Fletcher等[56]使用多重分子遺傳技術(shù)對(duì)18世紀(jì)匈牙利家族墳?zāi)怪械?具木乃伊進(jìn)行分析，以調(diào)查結(jié)核病的流行病學(xué)及其進(jìn)化，結(jié)果證明了Mtb在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了許多次基因缺失和突變這一理論。因此，隨著Mtb基因分型技術(shù)及流行病學(xué)的不斷深入研究，從而能夠更加準(zhǔn)確地為Mtb在傳播過(guò)程中的進(jìn)化狀況提供理論依據(jù)。

許多研究學(xué)者認(rèn)為，Mtb基因組可被用來(lái)進(jìn)行進(jìn)化分析，特別是基因組中的同義SNP，由于研究認(rèn)為其不受選擇壓力的影響，被認(rèn)為是進(jìn)行Mtb進(jìn)化分析的理想生物學(xué)標(biāo)志。Filliol等[57]用212個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)來(lái)源于全球的323株樣品進(jìn)行了檢測(cè)，并依據(jù)SNP標(biāo)志的發(fā)生情況進(jìn)行聚類(lèi)分析，將Mtb分為6個(gè)主要的SNP聚集群和5個(gè)亞群。與Sreevatsan等[19]研究結(jié)果具有很好的一致性。Schurch等[53]研究認(rèn)為，這種患者間的菌株進(jìn)化速度和進(jìn)化模式分析表明，Mtb在體內(nèi)的分子進(jìn)化是由短時(shí)間內(nèi)的變異暴發(fā)和相對(duì)較高的基因組穩(wěn)定性共同決定的，這種進(jìn)化與變異機(jī)制為抗結(jié)核疫苗和藥物的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用，以及Mtb感染暴發(fā)的管理提供了重要依據(jù)。

(四)在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室交叉污染中的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)室可能由于污染而造成假陽(yáng)性，因此實(shí)驗(yàn)室交叉污染是進(jìn)行Mtb分子生物學(xué)診斷和鑒定不容忽視的問(wèn)題。主要發(fā)生在樣本處理的任何一環(huán)節(jié)，以及試劑的污染[58]。Small等[59]指出DNA指紋分型方法對(duì)Mtb有很好的分型能力，而且也證實(shí)了實(shí)驗(yàn)室交叉污染造成的假陽(yáng)性。目前，VNTR及Spoligotyping等以PCR為基礎(chǔ)的分型方法也可以鑒定和排除交叉污染[58,60]。如果條件允許，用基因分型的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的控制能夠保證結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷的正確性，防止臨床結(jié)核病的誤診。

(五)在結(jié)核病聚集性發(fā)病中的評(píng)估作用

當(dāng)一個(gè)地方在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)結(jié)核病的聚集性發(fā)病，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查，可以確定傳染源、判斷流行危害程度及危險(xiǎn)因素，同時(shí)還可以幫助制定控制和預(yù)防結(jié)核病傳播的有效措施。IS6110-RFLP基因分型技術(shù)就很適合運(yùn)用于結(jié)核病聚集性發(fā)病的流行病學(xué)評(píng)估[61]。

(六)在Mtb菌種鑒定與耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)具有天然的對(duì)抗結(jié)核藥物的耐受性，傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和NTM耗時(shí)長(zhǎng)，步驟繁瑣。近些年發(fā)展起來(lái)并廣泛使用的Bactec 460或960快速培養(yǎng)技術(shù)大大縮短了培養(yǎng)周期，但只能檢測(cè)是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群還是NTM，依然無(wú)法達(dá)到快速檢測(cè)的要求?；蛐酒夹g(shù)應(yīng)用于分枝桿菌的菌種鑒定和耐藥性檢測(cè)等方面，成為21世紀(jì)分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。通過(guò)國(guó)內(nèi)、外學(xué)者對(duì)基因芯片在Mtb菌種鑒定與耐藥檢測(cè)中應(yīng)用的研究，為正確了解關(guān)系密切的分枝桿菌，以及對(duì)高同源性分枝桿菌的準(zhǔn)確鑒定和合理設(shè)計(jì)疫苗提供了新的思路。該方法由于具有高通量的特性，可將所有突變的探針固定到一張芯片上，只需1次雜交，即可獲得某一菌株對(duì)所有藥物的敏感度結(jié)果，因而對(duì)指導(dǎo)醫(yī)生合理用藥的價(jià)值非常大，并對(duì)結(jié)核病的早期診斷、Mtb耐藥性快速檢測(cè)及耐藥性結(jié)核病的有效防治和控制疾病的傳播具有重要的意義[62]。

Mtb和牛分枝桿菌均可感染人類(lèi)并導(dǎo)致患者體征、影像學(xué)幾乎相同的臨床癥狀，而臨床上卻需要采用不同的治療方案。因此，患者致病菌株的快速菌種鑒定也是臨床上采取針對(duì)性治療的迫切需要。Chauhan等[63]研究發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌和卡介苗narK2X基因啟動(dòng)子區(qū)域有1個(gè)SNP突變，這個(gè)SNP的存在造成兩者與結(jié)核分枝桿菌在缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)表達(dá)硝酸還原酶和亞硝酸還原酶能力的差異。通過(guò)檢測(cè)這個(gè)SNP可快速、準(zhǔn)確地將Mtb與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群其他成員區(qū)分開(kāi)。

目前研究認(rèn)為，Mtb耐藥性的發(fā)生由多個(gè)基因突變導(dǎo)致，耐藥性相關(guān)基因的SNP檢測(cè)成為Mtb藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的重要方法[64-66]。近年來(lái)，隨著Mtb二線(xiàn)藥物的應(yīng)用和耐藥菌株的出現(xiàn)，二線(xiàn)藥物耐藥相關(guān)基因的SNP研究也多有報(bào)道[67]。這些耐藥性相關(guān)SNP的發(fā)現(xiàn)和其檢測(cè)方法的建立，為Mtb藥敏試驗(yàn)的快速鑒定奠定了基礎(chǔ)，也將為臨床上針對(duì)耐藥性結(jié)核病的藥物治療提供支持。

三、Mtb分型技術(shù)展望

從20世紀(jì)90年代到現(xiàn)在，用于結(jié)核病流行病學(xué)研究的分型方法已有很多種。除了上述提到的幾種分型方法外，還有隨機(jī)引物PCR、IS6110反轉(zhuǎn)PCR，以及混合連接PCR等技術(shù)也起到了很重要的作用[60,68]，而且這些方法也在不斷地改進(jìn)。目前，全基因組測(cè)序逐步開(kāi)始應(yīng)用于Mtb分型及結(jié)核病流行病學(xué)的研究[48-50]。Mtb基因分型技術(shù)已廣泛用于追蹤菌株的傳播、區(qū)分內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染、快速菌種鑒定與耐藥、耐多藥的檢測(cè)，以及結(jié)核病暴發(fā)疫情的分析、判斷實(shí)驗(yàn)室污染等。

綜上所述，基因分型方法是監(jiān)測(cè)Mtb流行和傳播的有效手段，但不同的基因分型方法各有其特點(diǎn)與存在的不足。例如，目前的基因芯片、全基因組測(cè)序分析技術(shù)還存在成本昂貴、檢測(cè)敏感度較低、分析范圍較窄等問(wèn)題。因此，相應(yīng)技術(shù)在臨床上的常規(guī)應(yīng)用還存一定困難。但隨著研究的不斷深入，這些技術(shù)在分枝桿菌基因分型、菌種鑒定和耐藥基因檢測(cè)等方面將起到更重要的作用。同時(shí)，我們相信隨著高科技及分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，相關(guān)技術(shù)也會(huì)逐步從科研應(yīng)用于臨床，為我們更深入地進(jìn)行Mtb相關(guān)研究提供新的研究方法和研究方向，也會(huì)為臨床Mtb感染的快速診斷和治療提供便利；將會(huì)促進(jìn)我們對(duì)Mtb進(jìn)化、致病機(jī)制、流行與傳播特征，以及感染后免疫和耐藥發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并將為最終實(shí)現(xiàn)結(jié)核病預(yù)防和控制目標(biāo)提供幫助[69]。

在選擇基因分型技術(shù)實(shí)施結(jié)核病分子流行病學(xué)研究時(shí)，我們應(yīng)根據(jù)不同研究目的選擇合適的方法，或者多種方法聯(lián)合使用，并結(jié)合傳統(tǒng)的流行病學(xué)資料進(jìn)行綜合分析，以便得出可靠結(jié)論。結(jié)核分枝桿菌分型鑒定技術(shù)在結(jié)核病研究領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用推動(dòng)了結(jié)核病流行病學(xué)的迅速發(fā)展，在研究結(jié)核病的病原演變、跟蹤，以及確定傳染源、確定流行病學(xué)事件、揭示疾病傳播機(jī)制等方面發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，此類(lèi)研究正與新興的遺傳信息學(xué)相結(jié)合，使人們對(duì)Mtb的認(rèn)知更加深入和明確，相應(yīng)成果能夠?yàn)楦茖W(xué)地制定結(jié)核病防控策略提供依據(jù)。

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(本文編輯：范永德)

The application of genotyping method ofMycobacteriumtuberculosis

TIANLi-li*,DINGBei-chuan,ZHUBing-dong,WANGSu-min.

BeijingResearchInstituteforTuberculosisControl,Beijing100035,China

WANGSu-min,Email: 13910678649@126.com

The genotyping ofMycobacteriuntuberculosis(M.tuberculosis) is an effective method to monitor the epidemic and spread of tuberculosis. Many genotyping methods have been used for epidemiological study on tuberculosis, but different genotyping methods have different features. We should choose the appropriate single me-thod or combin different methods together according to the research purpose, and draw the conclusion associating with the traditional epidemiological data. The identification technique has been playing an important role in strain identification, detection of the drug resistance and multi-drug resistance, pathogen evolution, tracking and determining the source of infection, and the epidemiological events, and revealing the spread of disease mechanisms. In addition, such research is combining with the emerging bioinformatics and genetics and the results could provide the basis of control strategies of TB more scientific.

Mycobacteriumtuberculosis； Genotyping techniques

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.08.018

100035 北京結(jié)核病控制研究所中心實(shí)驗(yàn)室(田麗麗、丁北川、王甦民)； 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室(祝秉東)

王甦民，Email：13910678649@126.com

2015-04-07)