李妍 張?zhí)烊A 鮮小萍 王西娣 陳美玲 楊健 王蕊

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·論著·

Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核的價(jià)值

李妍 張?zhí)烊A 鮮小萍 王西娣 陳美玲 楊健 王蕊

目的 探討利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Xpert Mtb/RIF)在結(jié)核病診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法 對(duì)200例初治結(jié)核病患者標(biāo)本，包括痰液、肺泡灌洗液、胸腹腔積液和腦脊液各50例，分別進(jìn)行抗酸染色法、固體培養(yǎng)法、藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)及Xpert Mtb/RIF檢測(cè)，分別以固體培養(yǎng)結(jié)果和藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析Xpert Mtb/RIF檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa值。Xpert Mtb/RIF檢測(cè)和金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)(Kappa檢驗(yàn))，Κ>0.8認(rèn)為兩者一致性極好。結(jié)果 以固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)，以及抗酸染色法總體敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、Kappa值分別為94.52%(69/73)、90.55%(115/127)、85.19%(69/81)、96.64%(115/119)和0.83，以及65.75%(48/73)、96.06%(122/127)、90.57%(48/53)、82.99%(122/147)和0.66；以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)，Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥性的總體敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa值分別為93.75%(15/16)、100.00%(53/53)、100.00%(15/15)、98.15%(53/54)和0.96。 結(jié)論 Xpert Mtb/RIF法可快速檢測(cè)肺內(nèi)、外結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性，具有良好的應(yīng)用前景。

結(jié)核, 肺/診斷； 結(jié)核/診斷； 抗藥性, 細(xì)菌； 利福平； 微生物敏感性試驗(yàn)； 核酸擴(kuò)增技術(shù)

結(jié)核病是危害人類(lèi)健康的傳染病之一，其早期診斷更具有臨床意義，因此，尋找一種快速、簡(jiǎn)便和敏感度高的檢測(cè)方法顯得尤其迫切。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的分子診斷技術(shù)不斷的涌現(xiàn)，利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Xpert Mtb/RIF)便是其中之一。該方法國(guó)內(nèi)以痰標(biāo)本為研究對(duì)象研究較多，而對(duì)肺外結(jié)核的應(yīng)用報(bào)道尚少[1-2]，所以該方法還有許多未知領(lǐng)域值得探討。本課題將抗酸染色法、固體培養(yǎng)法和Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)在肺內(nèi)、外標(biāo)本中的檢測(cè)情況進(jìn)行比較，初步評(píng)價(jià)該技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥的應(yīng)用效果，報(bào)告如下。

資料和方法

一、材料

200例初治結(jié)核病患者標(biāo)本，來(lái)自我所及陜西省結(jié)核病防治院2014年3月至2015年2月，經(jīng)臨床或細(xì)菌學(xué)檢查確診[3]的門(mén)診和住院結(jié)核病患者。包括痰液、肺泡灌洗液、胸腹腔積液和腦脊液各50份。標(biāo)本采取前未使用抗結(jié)核藥物治療。

二、儀器和試劑

GeneXpert Dx儀器、 GeneXpert Mtb/RIF Cartridge檢測(cè)盒(批號(hào)：16201)及樣品試劑(sample reagent，SR)(批號(hào)：3244C034)均購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司；分枝桿菌涂片鏡檢萋-尼氏染色液(批號(hào)：4140424)、中性羅氏培養(yǎng)基(批號(hào)：20140912)和分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)培養(yǎng)基(批號(hào)：20140912)均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

三、方法

所有標(biāo)本同時(shí)采用抗酸染色法、固體培養(yǎng)法、比例法藥敏試驗(yàn)及Xpert Mtb/RIF檢測(cè)。

1. 抗酸染色法：采用離心濃縮法，操作參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[4]進(jìn)行。

2. 固體培養(yǎng)法：采用中和離心法，操作參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[4]進(jìn)行。

3. 藥敏試驗(yàn)及菌種鑒定：采用比例法，操作參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[4]進(jìn)行。

4. Xpert Mtb/RIF技術(shù)：取1 ml標(biāo)本加入前處理管中，視標(biāo)本性狀加入2倍標(biāo)本體積的SR標(biāo)本處理液，渦旋振蕩15～30 s，靜置15 min。打開(kāi)檢測(cè)盒，吸取2 ml處理后樣品緩慢加入檢測(cè)盒，然后將檢測(cè)盒放入檢測(cè)模塊，儀器開(kāi)始進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)試。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接觀察測(cè)試結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Xpert Mtb/RIF檢測(cè)和金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)(Kappa檢驗(yàn))，K≤0.40時(shí)，表明一致性較差；0.40≤K≤0.60時(shí)，表明中度一致；0.600.8認(rèn)為兩者一致性極好。

結(jié) 果

一、采用抗酸染色法、固體培養(yǎng)法、Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)Mtb結(jié)果

200份不同類(lèi)型樣本(包括痰液、肺泡灌洗液、胸腹腔積液和腦脊液各50份)同時(shí)采用抗酸染色法、固體培養(yǎng)法和Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)，總體陽(yáng)性檢出率分別為26.50%(53/200)、36.50%(73/200)和40.50%(81/200)。Xpert Mtb/RIF技術(shù)總體陽(yáng)性率(40.50%)高于抗酸染色法陽(yáng)性率(26.50%)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.80,P<0.01)；高于固體培養(yǎng)法陽(yáng)性率(36.50%)，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.68,P>0.05)；抗酸染色法陽(yáng)性率(26.50%)與固體培養(yǎng)法陽(yáng)性率(36.50%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.63,P<0.05)。(表1)。

二、采用抗酸染色法、Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)Mtb結(jié)果

200份不同類(lèi)型樣本同時(shí)采用3種檢測(cè)方法檢測(cè)。以固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)總體敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為94.52%(69/73)、90.55%(115/127)、85.19%(69/81)和96.64%(115/119)，對(duì)Xpert Mtb/RIF技術(shù)和固體培養(yǎng)法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，K=0.83，兩者具有極好的一致性(表2)。

表1 3種檢測(cè)方法對(duì)不同樣本的陽(yáng)性檢出率比較

注a：固體培養(yǎng)法相比較；b：與Xpert Mtb/RIF技術(shù)相比較；c：與抗酸染色法相比較

表2 不同樣本Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)Mtb的結(jié)果(以固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn))

表3 不同樣本抗酸染色法檢測(cè)Mtb的結(jié)果(以固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn))

以固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，抗酸染色法檢測(cè)總體敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為65.75%(48/73)、96.06%(122/127)、90.57%(48/53)和82.99%(122/147)，對(duì)抗酸染色法和固體培養(yǎng)法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，K=0.66，兩者有較好一致性(表3)。

三、Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)RFP耐藥的結(jié)果

所有樣本通過(guò)固體培養(yǎng)共得到73例陽(yáng)性菌株，經(jīng)菌種初步鑒定，其中有4例為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，其余69例均為Mtb。最終可進(jìn)行Xpert RIF比對(duì)分析的結(jié)核分枝桿菌為69例。69例結(jié)核分枝桿菌，Xpert Mtb/RIF技術(shù)與藥敏試驗(yàn)分別有15例和16例耐RFP結(jié)核分枝桿菌，耐藥率分別為21.74%(15/69)和23.19%(16/69)，二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.04,P>0.05)。兩種方法檢測(cè)對(duì)RFP均敏感者53例，均耐藥者15例，二種方法所得結(jié)果一致率為98.55 %(68/69)。

以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)，采用Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)69例陽(yáng)性標(biāo)本中RFP的耐藥性，其敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為93.75%(15/16)、100.00%(53/53)、100.00%(15/15)和98.15%(53/54)，對(duì)Xpert Mtb/RIF技術(shù)和藥敏試驗(yàn)進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，K=0.96，兩者具有極好的一致性(表4)。

表4 Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)RFP耐藥性的結(jié)果 (以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn))

討 論

一、Xpert Mtb/RIF技術(shù)的檢測(cè)原理及特點(diǎn)

在我國(guó)，結(jié)核病傳統(tǒng)的診斷方法有涂片鏡檢和分枝桿菌培養(yǎng)等。涂片法簡(jiǎn)單、快速，但容易漏檢，尤其對(duì)于含菌量較低的肺外標(biāo)本更是難以檢出[5]。培養(yǎng)法是檢測(cè)Mtb的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)長(zhǎng)。至于藥敏試驗(yàn)，目前常用的方法有絕對(duì)濃度法或比例法，但需要2～3個(gè)月才能獲到結(jié)果，往往影響患者用藥時(shí)間。近年來(lái)出現(xiàn)的Xpert Mtb/RIF新技術(shù)，該技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥決定區(qū)rpoB基因設(shè)定引物和探針，進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，根據(jù)其是否發(fā)生基因突變來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中是否含有結(jié)核分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌是否對(duì)利福平耐藥。整個(gè)過(guò)程只需2 h，是將PCR所需的3個(gè)步驟即樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增和檢測(cè)集于一體的半巢式多重實(shí)時(shí)熒光半定量檢測(cè)技術(shù)。該方法快速、簡(jiǎn)便，對(duì)生物安全要求相對(duì)較低，最大程度地減少了操作中污染的可能性。

二、Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測(cè)肺結(jié)核及肺外結(jié)核的效能分析

研究表明，Xpert Mtb/RIF技術(shù)對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值已經(jīng)逐步得到證實(shí)[6]，其敏感度為 90.40%、特異度為98.40%，但對(duì)肺外診斷研究尚不一致。本實(shí)驗(yàn)選用200例肺內(nèi)、外結(jié)核患者的4種類(lèi)型標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以固體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，肺內(nèi)痰標(biāo)本和肺泡灌洗液的敏感度和特異度分別為97.50%(39/40)、80.00%(8/10)，95.24%(20/21)和82.76%(24/29)，與張治國(guó)等[1]和高漫等[7]報(bào)道的敏感度稍高、特異度稍低。原因可能與本實(shí)驗(yàn)的選取標(biāo)本例數(shù)較少有關(guān)，也可能與入選對(duì)象標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，這就需要在敏感度和特異度之間尋找平衡點(diǎn)。肺外標(biāo)本中，采用Xpert Mtb/RIF技術(shù)，胸腹腔積液敏感度87.50%(7/8)高于Tortoli 等[8]報(bào)道的44.40%；腦脊液的敏感度為75.00%(3/4)低于Tortoli等[8]報(bào)道的85.70%；總體特異度為90.55%(115/127)略低于Vadwai等[9]報(bào)道的97.00%。上述差異可能與本實(shí)驗(yàn)選取的標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，此研究還有待于在今后的工作中繼續(xù)完善和補(bǔ)充。

三、Xpert Mtb/RIF技術(shù)與抗酸染色法、固體培養(yǎng)法及藥敏試驗(yàn)比較的優(yōu)勢(shì)

有報(bào)道Xpert Mtb/RIF技術(shù)的臨床檢出限為131菌落形成單位(CFU)/ml[10]，抗酸染色鏡檢檢出限為5×103CFU/ml以上，培養(yǎng)為10～100 CFU/ml[11]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用抗酸染色、固體培養(yǎng)及Xpert Mtb/RIF法，4種不同類(lèi)型標(biāo)本均以Xpert Mtb/RIF法陽(yáng)性率最高，其次為培養(yǎng)法，抗酸染色法陽(yáng)性率最低；并且以固體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，Xpert Mtb/RIF技術(shù)的總體敏感度94.52%(69/73)高于抗酸染色法敏感度65.75%(48/73)，Xpert Mtb/RIF技術(shù)與固體培養(yǎng)法的一致性(Κ=0.83)高于抗酸染色法與固體培養(yǎng)法的一致性(Κ=0.66)。本研究結(jié)果還顯示，以藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，Xpert Mtb/RIF和藥敏試驗(yàn)具有極好的一致性，該結(jié)果與Boehme 等[1]的報(bào)道基本一致。因此，Xpert Mtb/RIF技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)抗酸染色、培養(yǎng)技術(shù)而言，不但提高了敏感度，而且最大程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間，尤其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)更具優(yōu)勢(shì)。

Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)是世界衛(wèi)生組織(WHO)及國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦的一種全新的結(jié)核病快速檢測(cè)新方法，具有快速、簡(jiǎn)單和敏感度高，而生物安全要求不高，且能同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥菌株等優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)于陽(yáng)性檢出率極低的肺外標(biāo)本更具臨床意義。然而，該技術(shù)所用儀器、試劑價(jià)格昂貴，其后續(xù)模塊維護(hù)校準(zhǔn)也需較大費(fèi)用。因此，在資源允許及結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，Xpert Mtb/RIF技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值較高，對(duì)結(jié)核病的早期診斷及規(guī)范化治療能夠起到很好的作用。

[1] 張治國(guó)，歐喜超，孫倩，等．利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究．中國(guó)防癆雜志，2013，35(1)：13-16．

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[7] 高漫，鄒遠(yuǎn)嫵，白廣紅，等．Xpert Mtb/RIF Assay在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36(3)：413-414．

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(本文編輯：范永德)

The value of Xpert Mtb/RIF detection assay in the diagnosis of pulmonary tuberculosis and extrapulmonary tuberculosis

LIYan，ZHANGTian-hua，XIANXiao-ping，WANGXi-di，CHENMei-ling，YANGJian，WANGRui.

Referencelaboratory，ShaanxiProvincialInstituteforTuberculosisControlandPrevention，Xi’an710048，China

ZHANGTian-hua，Email：zhthfzhk@126.com

Objective To investigate clinical value of XpertMycobacteriumtuberculosis/Rifampicin(Xpert Mtb/RIF)assay on detection of tuberculosis. Methods We tested 200 samples from initial treatment of tuberculosis patients including sputum, bronchoalveolar lavage fluid, Hydrothorax and ascites, cerebrospinal fluid, each of which had 50 cases, respectively. These samples were detected by acid-fast stain，solid culture，proportional method drug sensitivity tests and Xpert Mtb/RIF assay. Using solid culture result and drug sensitivity tests result as gold standard respectively. The sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive values andKappavalue of Xpert Mtb/RIF assay in detecting Mycobacterium and refampin resistance were analyzed. In the consistency test for Xpert Mtb/RIF assay and the gold standard test (Kappatest), both of the two test had an excellent agreement whenkappavalue was more than 0.8. Results According to the solid culture result as gold standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive values andKappaof Xpert Mtb/RIF assay and acid-fast stain in detecting tuberculosis were 94.52%(69/73)，90.55%(115/127)，85.19%(69/81)，96.64%(115/119) and 0.83 and 65.75%(48/73)，96.06%(122/127)，90.57%(48/53)，82.99%(122/147) and 0.66 respectively. According to the drug sensitivity tests result as gold standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive values andKappain detecting refampin resistance are 93.75%(15/16)，100.00%(53/53)，100.00%(15/15)，98.15%(53/54) and 0.96. Conclusion Xpert Mtb/RIF assay has a good application prospect in rapidly detecting pulmonary and extrapulmonary tuberculosis and refampin resistance.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Tuberculosis/diagnosis； Drug resistance, bacterial； Rifampin； Microbial sensitivity tests； Nucleic cid amplification techniques

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.003

陜西省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(2014D25)

710048 西安，陜西省結(jié)核病防治研究所參比實(shí)驗(yàn)室(李妍、王西娣、陳美玲、楊健、王蕊)，所長(zhǎng)辦公室(張?zhí)烊A、鮮小萍)

張?zhí)烊A，Email：zhthfzhk@126.com

2015-04-10)