王 娟，汪選斌，李洪亮，歐陽露*

0 引言

補(bǔ)腎化瘀浸膏由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、熟地、當(dāng)歸、地鱉蟲等五味中藥制成，前期動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，該方能夠有效調(diào)節(jié)骨代謝，改變骨吸收大于骨形成的負(fù)平衡狀態(tài)，增加骨量，抑制骨丟失，對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有良好的治療作用，具有很高的臨床應(yīng)用和開發(fā)價值［1-3］。前期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究只建立了方中淫羊藿、骨碎補(bǔ)的含量測定方法［4-5］。毛蕊花糖苷為方中主藥熟地的主要活性成分，屬苯丙素苷類化合物，具有多種藥理活性［6］。本實(shí)驗(yàn)旨在建立補(bǔ)腎化瘀浸膏中毛蕊花糖苷含量測定方法，完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥安全有效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀(LC-20AD泵、SIL-20A自動進(jìn)樣器、SPD-M20A紫外檢測器、LC-Solution色譜工作站);KQ-500PV型數(shù)控超聲波清洗器，F(xiàn)A2004電子分析天平。

1.2 試藥 補(bǔ)腎化瘀浸膏(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，批號:20140213、20140225、20140319)，毛蕊花糖苷對照品(批號:111530-201310，北京浩天永泰科技有限公司，含量:93.3%)，甲醇(分析純)，乙腈(色譜純)，流動相用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:ODS Phenomenex Gemini C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。流動相:乙腈－0.1%醋酸溶液(16∶84);流速:1.0 mL/min;檢測波長:334 nm;進(jìn)樣量:10 μL，柱溫:30 ℃，理論塔板數(shù)不低于5 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 毛蕊花糖苷對照品溶液的配制 取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 mL約含0.3 mg的毛蕊花糖苷溶液，搖勻即得。

2.2.2 熟地對照品溶液的配制 取熟地約10 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，精密稱定，超聲1 h，放冷至室溫，以50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻?yàn)V過，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取補(bǔ)腎化瘀浸膏約12 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，精密稱定，超聲提取1 h，靜置放冷至室溫，以50%甲醇補(bǔ)足損失重量，濾過，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 陰性對照液的配制 按處方和工藝制法制備不含熟地的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下制備的毛蕊花糖苷對照品溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動相定容。分別量取0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，流動相定容搖勻，制得濃度為 1.5、3.0、6.0、15.0、30.0 μg/mL的對照品系列溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，以質(zhì)量濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸，得線性范圍和回歸方程，毛蕊花糖苷進(jìn)樣量在0.015～0.300 μg之間線性關(guān)系良好?；貧w方程Y=16 763 X－7 948.9，R=0.999 6。

2.4 專屬性考察 取“2.2.1”項(xiàng)下毛蕊花糖苷對照品溶液、“2.2.2”項(xiàng)下熟地對照品溶液、“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液和“2.2.4”項(xiàng)下陰性對照品溶液各進(jìn)樣10 μL，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示供試品溶液中毛蕊花糖苷分離度好，處方中其他成分對毛蕊花糖苷的測定無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 補(bǔ)腎化瘀浸膏HPLC色譜圖注:A.對照品，B.熟地，C.供試品，D.陰性對照品

2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣10 μL，重復(fù)6次，以毛蕊花糖苷峰面積計(jì)算RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批補(bǔ)腎化瘀浸膏(批號:20140213)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定毛蕊花糖苷的峰面積，RSD為1.58%，說明該法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液(批號:20140213)，分別在 0、1、2、4、8、12 h 進(jìn)樣 10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算毛蕊花糖苷的含量，RSD為0.34%，說明浸膏供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知毛蕊花糖苷含量的補(bǔ)腎化瘀浸膏6份，精密稱定，置100 mL容量瓶中，精密加入毛蕊花糖苷對照品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定含量，求得毛蕊花糖苷的回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，每批精密稱取3份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定含量，結(jié)果見表2。

3 討論

對熟地的質(zhì)量控制與評價，有文獻(xiàn)報道以梓醇含量作為檢測指標(biāo)［7-9］，但梓醇對熱不穩(wěn)定，在熟地中含量極少，不易測出，且在210 nm最大吸收波長處干擾雜質(zhì)多。近年來對毛蕊花糖苷的藥理研究表明其對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)均具有明顯的藥理作用，特別是針對老年癡呆等老年性疾病、慢性腎炎等免疫性疾病具有明顯的治療作用［10］，因此，本實(shí)驗(yàn)參考2010版《中國藥典》，以毛蕊花糖苷含量作為熟地質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，建立補(bǔ)腎化瘀浸膏中毛蕊花糖苷的HPLC含量測定方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)建立的補(bǔ)腎化瘀浸膏中毛蕊花糖苷的HPLC含量測定方法操作簡便，精密度高，穩(wěn)定性良好，可用于補(bǔ)腎化瘀浸膏的質(zhì)量控制與評價。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

［1］ 歐陽露，汪選斌，肖雨清，等.補(bǔ)腎化瘀浸膏對去勢大鼠血清ALP、E2及IL-6 水平的影響［J］.中國藥師，2009，12(10):1342-1344.

［2］ Ouyang L，Zhang Q，Ruan X，et al.Treatment effect of Bushen Huayu extract on postmenopausal osteoporosis in vivo［J］.Exp Ther Med，2014，7(6):1687-1690.

［3］ 歐陽露，汪選斌，國宏莉，等.補(bǔ)腎化瘀浸膏對去勢大鼠骨密度及骨組織形態(tài)的影響［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28(12):1533-1535.

［4］ 歐陽露，汪選斌，李洪亮，等.HPLC測定補(bǔ)腎化瘀膏中淫羊藿苷的含量［J］.中國藥師，2010，13(1):13-15.

［5］ 歐陽露，夏鵬，李洪亮，等.HPCL法同時測定補(bǔ)腎化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33(9):125-127.

［6］ 許敬英，蘇奎，周靜.苯丙素苷類化合物的研究進(jìn)展(Ⅱ)［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(7):1770-1772.

［7］ 陳天朝，翟來超.HPLC同時測定地黃中梓醇與毛蕊花糖苷的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(5):105-107.

［8］ 邱建國，張汝學(xué)，賈正平，等.HPLC法測定地黃、不同提取物及熟地黃中的梓醇［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(1):23-25.

［9］ 祝巍，張玉萍.HPLC法測定地黃不同炮制品中梓醇的含量［J］.江西中醫(yī)藥，2008，39(11):71-72.

［10］ 邊寶林，王宏潔，楊健.5種不同藥材中毛蕊花糖苷的含量比較［J］.中國中藥雜志，2010，35(6):739-740.