李蘭茹，馬慧萍

0 引言

喜馬拉雅紫茉莉(Mirabilis himalaica)為紫茉莉科植物喜馬拉雅紫茉莉的干燥根，是藏醫(yī)常用藥物，味甘、辛，具有壯陽、引黃水、治下身寒癥［1］、溫腎、利尿排石的功效，常用于治療腎寒浮腫、腰及關(guān)節(jié)痛、下腹痛及膀胱結(jié)石［2］、各種性病及一些病毒感染［3］。目前已發(fā)現(xiàn)該藥材中含有多種甜菜素、氨基酸、有機酸、三萜、甾體、脂肪酸、葫蘆巴堿和半乳糖等多種成分，而對其多酚類物質(zhì)的研究尚未見報道。多酚是一類抗氧化活性物質(zhì)的重要成分，具有較高的食品保健和藥用開發(fā)價值。本實驗以喜馬拉雅紫茉莉為原料，采用福林酚法(Folin-Ciocalteu Method，F(xiàn)C法)對其總多酚含量進行測定，以期為喜馬拉雅紫茉莉的深入開發(fā)利用以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV2800SPC紫外分光光度計(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，AE200電子天平(上海梅特勒－托利多公司)，SK3300LH型超聲波清洗機(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。喜馬拉雅紫茉莉藥材(產(chǎn)地:甘肅，購于青海西寧三江寶商貿(mào)有限公司);沒食子酸對照品(批號:110831-200302，中國藥品生物制品檢定所);鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉、磷酸、鹽酸等試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 喜馬拉雅紫茉莉藥材提取液的制備 將供試藥材用粉碎機粉碎，過100目篩。取供試藥材1 g，精密稱定，加入70%乙醇20 mL，超聲提取2次(功率160 W，頻率59 kHz)，每次15 min，過濾，濾液合并后定容至50 mL量瓶，搖勻，再精密吸取3 mL定容至10 mL，搖勻，即為喜馬拉雅紫茉莉提取液。

2.2 對照品溶液的制備 取沒食子酸適量，精密稱定(0.008 7 g)，置25 mL量瓶中，加去離子水制成每l mL含沒食子酸0.348 mg的溶液，低溫保存?zhèn)溆?。臨用稀釋成34.8 μg/mL的溶液。

2.3 福林酚(Folin-Ciocalteu，F(xiàn)C)試劑的制備取鎢酸鈉25 g，鉬酸鈉6.25 g，加水175 mL、85%磷酸12.5 mL、鹽酸25 mL，置磨圓底燒瓶中，緩緩加熱回流 10 h，放冷，再加硫酸鋰 37.5 g、水12.5 mL和0.2 mL雙氧水，開口加熱煮沸15 min，使雙氧水完全揮發(fā)，冷卻后用蒸餾水定容至250 mL，過濾，濾液置棕色瓶中避光儲存。臨用前用水稀釋5倍，搖勻，即得。

2.4 顯色條件的確定

2.4.1 最大吸收波長的確定 精密量取上述喜馬拉雅紫茉莉藥材提取液和對照品溶液各1.0 mL，分置10 mL容量瓶中，各加水至2 mL，加FC試劑 2 mL，搖勻，靜置 4～5 min，加 7.5%Na2CO3溶液2 mL，加水至刻度，搖勻，置于室溫反應(yīng)15 min后，同時作空白，在波長為 500～900 nm可見光區(qū)掃描，繪制吸收曲線。結(jié)果對照品溶液和供試品溶液在767 nm處均有最大吸收(圖1)，因此，選擇測定波長為767 nm。

圖1 對照品溶液和供試品溶液紫外吸收圖譜注:A.對照品溶液，B.供試品溶液

2.4.2 7.5%Na2CO3溶液最佳用量的確定 精密量取1.0 mL上述喜馬拉雅紫茉莉提取液5份，分置于10 mL容量瓶中，加水至2 mL，加FC試劑2 mL，搖勻，靜置 4～5 min，分別加入 7.5%Na2CO3溶液1、2、3、4、5 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，置于室溫反應(yīng)60 min后于767 nm波長下測定吸光度，根據(jù)吸光度確定7.5%Na2CO3溶液的最佳用量。由圖2可知，當(dāng)7.5%Na2CO3溶液加入量為3 mL時，吸光度最大。

2.4.3 FC試劑最佳用量的確定 精密量取1.0 mL上述喜馬拉雅紫茉莉提取液5份，分置于10 mL容量瓶中，加水至2 mL，分別加入FC試劑0.5、1、1.5、2、2.5 mL，搖勻，靜置 4 ～ 5 min，加入7.5%Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，置于室溫反應(yīng)60 min后于767 nm波長下測定吸光度，根據(jù)吸光度確定FC試劑的最佳用量。由圖3可知，當(dāng)FC試劑的加入量為2 mL時，吸光度最大，故確定FC試劑的最佳用量為2 mL。

圖3 FC試劑用量與吸光度的關(guān)系

2.4.4 最佳反應(yīng)時間的確定 精密量取1.0 mL上述喜馬拉雅紫茉莉提取液7份，分置于10 mL容量瓶中，加水至2 mL，加入FC試劑2.0 mL，搖勻，靜置4～5 min，加入7.5%Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，置于室溫反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 min 后，于 767 nm 波長下測定室溫下吸光度隨時間的變化，確定最佳反應(yīng)時間。由圖4可知，供試品溶液在室溫反應(yīng)60 min后吸光度趨于穩(wěn)定，故確定反應(yīng)時間為60 min。

綜上所述，最佳顯色反應(yīng)條件:FC試劑的加入量為2 mL，7.5%Na2CO3溶液加入量為3 mL，常溫反應(yīng)60 min，測定波長767 nm。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取沒食子酸對照品儲備液稀釋成34.8 μg/mL的溶液，分別精密量取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分置 10 mL 量瓶中，加水至3 mL，加入 FC試劑2.0 mL，搖勻，靜置4～5 min，再加入7.5%Na2CO3溶液3 mL，用水定容至刻度，搖勻，室溫放置 60 min，隨行空白，在767 nm處測定吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為 A=0.109 4 C+0.008 9，r=0.999 5，結(jié)果表明沒食子酸在濃度1.74～10.44 μg/mL的范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖4 顯色時間與吸光度的關(guān)系

2.5.2 精密度試驗 取同一份供試品溶液，測定吸收度值，平均值為0.656 6，RSD=0.07%，表明本法精密度較好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.1”項下的方法制備供試品提取液。精密吸取提取液1 mL，按“2.5.1”項下測定方法測定吸光度。結(jié)果RSD為0.86%(n=6)，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 精密吸取已知總多酚含量的樣品溶液6份，每份0.5 mL，分置10 mL量瓶中，再精密加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，按“2.5.1”項下測定方法測定吸光度，計算加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為98.57%，RSD為1.31%。見表1。

2.5.5 喜馬拉雅紫茉莉樣品中總多酚的含量測定 取過100目篩的供試藥材1 g，共6份，精密稱定，按“2.1”項下的方法制備供試品提取液。精密吸取提取液1 mL，按“2.5.1”項下測定方法測定吸光度，并根據(jù)回歸方程計算喜馬拉雅紫茉莉總多酚的含量。結(jié)果，該法測得樣品平均含量為8.946 mg/g，RSD為1.16%。見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

表2 樣品中總多酚含量測定結(jié)果

3 討論

目前常用的多酚類物質(zhì)含量測定的方法有高錳酸鉀法、酒石酸亞鐵比色法、原子吸收法、紫外分光光度法、福林酚比色法等［4-5］，相比較而言，福林酚法操作簡單，重現(xiàn)性好。但福林酚法目前尚無統(tǒng)一的實驗條件，文獻報道各種植物提取物的測定條件，例如檢測波長、加入福林酚的量、緩沖鹽碳酸鈉的濃度和量、反應(yīng)體系體積、反應(yīng)時間及溫度等都不盡相同。本文在參考文獻［6-11］的基礎(chǔ)上，建立了改良的Folin-Ciocalteu比色法，采用該方法測定喜馬拉雅紫茉莉總多酚的最佳條件為:FC試劑2 mL，7.5%Na2CO3溶液3 mL，常溫反應(yīng)60 min，測定波長 767 nm。平均回收率為98.57%(RSD=1.31%)，測得喜馬拉雅紫茉莉總多酚平均含量為8.946 mg/g。結(jié)果表明，該方法操作簡便、快捷、穩(wěn)定，適用于喜馬拉雅紫茉莉總多酚含量的測定。本實驗曾使用綠原酸作為對照品，但在波長400～900 nm進行全波長掃描時，對照品的最大吸收波長是782 nm，而樣品是769 nm，兩者相差13 nm。以沒食子酸為對照品，兩者的最大吸收波長均為767 nm，故以沒食子酸作為對照品。

在樣品提取實驗中，筆者考察了超聲和回流兩種提取方式，結(jié)果樣品分別超聲、回流提取30 min后含量相差無幾，考慮到超聲提取方法操作簡單，故選擇超聲提取方法。筆者還考察了不同的乙醇濃度(30%、50%、70%、90%)對總多酚提取效果的影響，結(jié)果表明用70%乙醇提取，總多酚含量較高。

綜上所述，本文所建立的喜馬拉雅紫茉莉總多酚的含量測定方法，將為喜馬拉雅紫茉莉的進一步研究工作提供科學(xué)依據(jù)。

［1］ 帝瑪爾·丹，增彭措.晶珠本草［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1986:88.

［2］ 青海省衛(wèi)生局.藏藥標(biāo)準(zhǔn)［M］.西寧:青海人民出版社，1979:20.

［3］ 何蘭，陳紹農(nóng)，陳耀祖.紫茉莉根中化學(xué)成分的研究［J］.中國野生植物資源，1996，(2):38.

［4］ 汪鐵山，張生潭，陳莉婧，等.半枝蓮總多酚含量測定與超聲提取工藝研究［J］.中藥材，2010，11(33):1808-1810.

［5］ 吳曉青，陳丹，邱紅鑫，等.芙蓉李中總多酚含量測定方法的優(yōu)選［J］.中國中醫(yī)藥科技，2011，2(18):131-133.

［6］ 楊盼盼，范海霞，楊麗花，等.喜馬拉雅紫茉莉根部化學(xué)成分研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(18):9641-9643.

［7］ 田海燕，劉靜，任菲菲，等.冬瓜子總多酚提取工藝優(yōu)選［J］.齊魯藥事，2012，31(5):260-262.

［8］ 唐金華，丁文歡，李永和，等.Folin-Ciocalteu比色法測定阜康阿魏葉中總多酚的含量［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，35(9):1143-1145.

［9］ 李彩東.珠子草總多酚含量研究［J］.中國藥物與臨床，2013，13(4):440-442.

［10］ 袁蘇寧，杜衛(wèi)軍，劉叢，等.不同來源薰衣草中總黃酮及總多酚含量測定研究［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5(9):641-644.

［11］ 黃筑艷，劉力，樂意.Folin-Ciocalteu比色法測定香椿皮中多酚含量［J］.廣州化工，2014，42(4):1261-127.