楊淑紅 李 玲 王 騰 姚 頤 蘇漢文 李 艷

屋塵螨是誘發(fā)過敏性哮喘、過敏性鼻炎和濕疹等疾病的重要變應(yīng)原，其發(fā)病機(jī)制尚未清楚。研究已經(jīng)證實上、下呼吸道慢性過敏性炎癥表現(xiàn)相似，即均有Th2細(xì)胞、肥大／嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及免疫球蛋白E（ⅠgE）的參與，包括細(xì)胞因子如白介素－2（ⅠL－2）、ⅠL－4、ⅠL－13、活化正常 T細(xì)胞表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)物（RANTES）和粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF）、炎性化學(xué)介質(zhì)等。遺傳與表觀遺傳變異之間的串?dāng)_在疾病發(fā)生和進(jìn)展中至關(guān)重要，單核酸多態(tài)性（SNP）在復(fù)雜炎癥性疾病如哮喘、過敏性鼻炎和濕診中所涉及的不同基因已獲得較多關(guān)注［1］。近年研 究［2，3］表 明，ⅠL 基 因 多 態(tài) 性 與 哮 喘的發(fā)生具有一定相關(guān)性，但具體到ⅠL－2和ⅠL－4基因多態(tài)性及其血清表達(dá)水平與屋塵螨過敏性哮喘的關(guān)系尚不清楚。因此，本文檢測分析屋塵螨過敏性哮喘患者血清ⅠL－2和ⅠL－4水平及其基因多態(tài)性變化，從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步闡明屋塵螨的致病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 病例資料和分組

本院門診及住院首次診斷為過敏性哮喘患者73例（過敏性哮喘組），過敏原檢查提示屋塵螨是主要變應(yīng)原。均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會支氣管哮喘防治指南［4］的診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊吣挲g4－45歲。排除妊娠及哺乳期婦女、1個月內(nèi)全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素者、上和／或下呼吸道感染患者以及自身免疫性疾病患者。納入病例按照臨床表現(xiàn)進(jìn)行分期［4］和分組：急性發(fā)作期組（n＝25）、慢性持續(xù)期組（n＝23）和臨床緩解期組（n＝25），另選體檢無過敏病史健康人群作為對照組（n＝81）。各組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

1.2 標(biāo)本采集和處理

抽取研究對象空腹靜脈血2－3ml置于促凝管中，分離血清后保存于－70℃冰箱，用于檢測血清ⅠL－2、ⅠL－4和 SⅠgE 水平；抽取研究對象靜脈血約2ml置于EDTA抗凝管中，保存于－20℃冰箱，用于提取外周血基因組DNA。

表1 各組基線資料

1.3 各組ⅠL－2、ⅠL－4和SⅠgE血清水平檢測

采用ELⅠSA。ⅠL－2和ⅠL－4檢測試劑盒購自武漢藍(lán)恒生物有限公司（批號：00641、01012），SⅠgE檢測試劑盒購自福州法瑪西亞普強生物有限公司（批號：4－29051）。三指標(biāo)均按照試劑盒說明進(jìn)行檢測與判讀結(jié)果。

1.4 ⅠL－2和ⅠL－4基因多態(tài)性分析

1.4.1 DNA提?。翰捎萌狣NA提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）提取外周血DNA，操作過程參照試劑說明書。－20℃保存。

1.4.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Ⅰnformation，NCBⅠ）網(wǎng)站提供的ⅠL－2和ⅠL－4基因序列，采用 Primer 5.0軟件進(jìn)行ⅠL－2rs6534349和ⅠL－4rs2227284單核苷酸引物設(shè)計（表2），用于檢測ⅠL－2rs6534349SNP 中 的 AA 型、GG 型 和 ⅠL－4 rs2227284SNP中的AA型、CC型。PCR擴(kuò)增條件為95℃3min預(yù)變性；95℃30s，58℃50s，72℃1 min，35個循環(huán)；最后72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%DNA凝膠電泳后，采用凝膠自動成像系統(tǒng)拍照后進(jìn)行電泳條帶定性分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件。ⅠL－2、ⅠL－4 和SigE血清水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間均數(shù)比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；ⅠL－2和ⅠL－4基因型分布用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 IL－2和IL－4基因分型引物及擴(kuò)增片段大小

2 結(jié) 果

2.1 各組血清ⅠL－2、ⅠL－4及SⅠgE水平比較

單因素方差分析顯示，急性發(fā)作期組、慢性持續(xù)期組、臨床緩解期組ⅠL－2、ⅠL－4和SⅠgE血清水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ⅠL－2在急性發(fā)作期組、慢性持續(xù)期組的血清水平明顯高于臨床緩解期組和對照組（P＜0.01）；而在急性發(fā)作期組與慢性持續(xù)期組、臨床緩解期組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ⅠL－4在急性發(fā)作期組、慢性持續(xù)期組血清水平明顯高于臨床緩解期組和對照組（P＜0.01），而在急性發(fā)作期組與慢性持續(xù)期組、臨床緩解期組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。SⅠgE在急性發(fā)作期組、慢性持續(xù)期組和臨床緩解期組的血清水平均明顯高于對照組（P＜0.01），而在急性發(fā)作期組、慢性持續(xù)期組和臨床緩解期組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組IL－2、IL－4和SIgE血清水平（±s）

表3 各組IL－2、IL－4和SIgE血清水平（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與臨床緩解期組比較，2）P＜0.01

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2.2 ⅠL－2、ⅠL－4與SⅠgE血清水平的相關(guān)性

屋塵螨過敏性哮喘患者隨疾病的進(jìn)展，其血清SlgE水平呈下降趨勢，而ⅠL－2呈增高趨勢，ⅠL－4呈降低趨勢（表3）。相關(guān)性分析結(jié)果為SⅠgE水平與ⅠL－2水平呈顯著負(fù)相關(guān)（為r＝－0.421，P＜0.01），與ⅠL－4水平呈顯著正相關(guān)（r＝0.522，P＜0.01）。

2.3 過敏性哮喘組和對照組ⅠL－2rs6534349、ⅠL－4 rs2227284基因型檢測結(jié)果

2.3.1 ⅠL－2rs6534349和ⅠL－4rs2227284基因型判讀：在ⅠL－2rs6534349凝膠電泳結(jié)果中，如果僅出現(xiàn)AA條帶或GG條帶，判讀為AA型（圖1a）或GG型（圖1b），如果同時出現(xiàn)AA和GG條帶，則判讀為AG型（圖1c）。在ⅠL－4rs2227284凝膠電泳結(jié)果中，如果僅出現(xiàn)AA條帶或CC條帶，判讀為AA型（圖1d）或CC型（圖1e），如果同時出現(xiàn) AA和CC條帶，則判讀為AC型（圖1f）。

2.3.2 過敏性哮喘組和對照組基因型分布頻率比較：過敏性哮喘組ⅠL－2rs6534349GG型頻率與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝8.17，P＜0.01）；而ⅠL－4rs2227284CC型頻率與對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝8.99，P＜0.01）。見表4。

圖1 ⅠL－2 rs6534349和ⅠL－4 rs2227284 SNP基因多態(tài)性電泳圖

表4 過敏性哮喘患者IL－2和IL－4基因型頻率比較（n，%）

3 討 論

哮喘是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率逐年上升。目前普遍認(rèn)為哮喘以多種炎性細(xì)胞增加／異常為特征，由多種炎性細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，肥大細(xì)胞等）和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞（上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等）及細(xì)胞組分（化學(xué)因子、細(xì)胞因子等）參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。哮喘不是一種同質(zhì)性疾病，但不同的表型由于支氣管黏膜腫脹和氣管平滑肌收縮產(chǎn)生了相同的癥狀［6］。在哮喘發(fā)作期，細(xì)胞因子發(fā)生紊亂，主要由于Th0向Th1與Th2細(xì)胞分化失調(diào)所致。

ⅠL－2由 Th細(xì)胞產(chǎn)生，與干擾素－r（ⅠFN－r）共同作用，對ⅠgE的產(chǎn)生及Th2克隆表達(dá)起抑制作用。本實驗結(jié)果顯示哮喘急性發(fā)作期組、慢性持續(xù)期組血清ⅠL－2水平下降，臨床緩解期組血清ⅠL－2水平恢復(fù)至對照組水平，表明隨著哮喘病情的緩解，ⅠL－2水平逐漸恢復(fù)正常。屋塵螨為外源性過敏原，引起外源性哮喘。外源性哮喘患者ⅠL－2水平低下的主要原因可能為：哮喘患者存在免疫功能障礙，ⅠL－2分泌不足；哮喘發(fā)作期患者可溶性白細(xì)胞介素－2受體（SⅠL－2R）增加，消耗ⅠL－2；哮喘發(fā)作期患者釋放大量組織胺，抑制外周血單個核細(xì)胞合成ⅠL－2［7］。另外，本研究中ⅠL－2rs6534349GG型在健康人群和哮喘患者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示哮喘的發(fā)作與宿主ⅠL－2基因多態(tài)性有一定關(guān)系。

ⅠL－4在 Th1、Th2細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位［8］。ⅠL－4是Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子之一，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)抗體同種型轉(zhuǎn)換效應(yīng)，ⅠgE水平升高，引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。本文結(jié)果顯示，ⅠL－4在哮喘急性發(fā)作期、慢性持續(xù)期水平升高，臨床緩解期恢復(fù)至對照組水平，表明過敏性哮喘患者出現(xiàn)Th1／Th2亞群功能失衡，表現(xiàn)為Th1功能低下，Th2功能亢進(jìn)［9］。過敏性哮喘患者活動期ⅠL－4水平增加的主要原因可能為：外源性抗原（屋塵螨）進(jìn)入機(jī)體后，使T細(xì)胞活化，Th0細(xì)胞表達(dá)ⅠL－4等細(xì)胞因子受體數(shù)量增加，引起以Th2為主的炎癥反應(yīng)，ⅠgE水平增高，嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等聚集、激活，分泌毒性蛋白，加重和誘導(dǎo)哮喘的急性發(fā)作，引起臨床癥狀［10］。而且ⅠL－4rs2227284CC型在健康人群和哮喘患者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示哮喘的發(fā)作與宿主ⅠL－4基因多態(tài)性也有一定關(guān)系。

在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病中，血清SⅠgE升高與疾病相關(guān)性的意義遠(yuǎn)大于總ⅠgE的變化，因此采用屋塵螨SⅠgE與ⅠL－2及ⅠL－4進(jìn)行相關(guān)性分析優(yōu)于采用總ⅠgE進(jìn)行相關(guān)性分析。本文結(jié)果顯示，SⅠgE在過敏性哮喘組患者中均增高，且三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明ⅠgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)持續(xù)參與了哮喘的發(fā)生，且與ⅠL－2和ⅠL－4的水平存在相關(guān)性。

綜上所述，屋塵螨引起的特異性哮喘患者存在Th1／Th2免疫調(diào)節(jié)失衡，其動態(tài)平衡的破壞參與了哮喘的發(fā)病。ⅠL2、ⅠL4等細(xì)胞因子形成的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在過敏性哮喘的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著極其重要的作用。