盛有明 孟凡星 趙永剛 王 冰 李愛玲 李宏偉 修瑞娟

高血壓作為一種危害嚴重的慢性非傳染性疾病，發(fā)病率高居心血管疾病之首［1］。由微血管、微淋巴管及其相關(guān)體液共同構(gòu)成的微循環(huán)體系是機體循環(huán)系統(tǒng)進行外周阻力與血壓調(diào)控、代謝物及信息交換、組織灌注調(diào)節(jié)等活動最主要、最直接的功能執(zhí)行單元［2，3］，微循環(huán)功能紊亂在高血壓發(fā)生、發(fā)展中的作用正受到越來越強烈的廣泛關(guān)注［4，5］。

微淋巴管在體液回流、輸出組織間隙中的大分子蛋白質(zhì)和顆粒物質(zhì)、調(diào)節(jié)組織間隙壓、發(fā)揮免疫功能、吸收乳糜顆粒中發(fā)揮著主要作用［6，7］。微淋巴管具有“泵”與“導(dǎo)管”的二重性［8，9］，特別是集合淋巴管的快速、大幅度自律運動是收集淋巴液、克服近心端阻力、推動淋巴液回流的主要動力來源［10］。持續(xù)主動地吸納組織液，并以淋巴液形式輸出，對于維持組織間隙的正常微環(huán)境至關(guān)重要［9］。而整個血管網(wǎng)絡(luò)也處在這一微環(huán)境之中。這種動態(tài)平衡一旦被打破，即會引起病理反應(yīng)，如水腫的發(fā)生［8］，還可能影響到血管的調(diào)控功能。因此，在探討高血壓病理機制時，除了對血管自身開展研究外，亦有必要深入探索微淋巴管功能狀態(tài)與高血壓發(fā)生發(fā)展之間的潛在聯(lián)系。本課題組前期研究［11］表明，8周齡和13周齡成年自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腸系膜集合淋巴管自律運動的收縮分數(shù)和收縮活性指數(shù)與對照組相比表現(xiàn)出不同程度地下降，提示持續(xù)高血壓可致淋巴微循環(huán)功能紊亂。本文報道自發(fā)性高血壓初期（3周齡）幼鼠淋巴微循環(huán)自律運動特征，旨在闡明高血壓不同發(fā)展階段的微淋巴管自律運動變化對高血壓發(fā)病機制的作用。

本文選擇的有關(guān)定量評價自律運動特征的指標能夠直觀地表現(xiàn)病理、生理條件下淋巴微循環(huán)的功能狀態(tài)［12－14］?；诟咚贁?shù)字圖像處理的自動化識別跟蹤測量技術(shù)是當前對微循環(huán)自律運動進行動態(tài)監(jiān)測最準確有效的手段［15，16］，因而實驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和可信度均高，可以為不同發(fā)展階段SHR腸系膜集合淋巴管自律運動功能狀態(tài)研究提供可靠的技術(shù)方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性3周齡SHR（SHR組，n＝11，平均壓130.8±10.7mmHg）和對照 Wistar大鼠 （Wistar組，n＝11，平均壓111.2±13.3mmHg）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2012－0001。兩組大鼠血壓差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－3.56，P＜0.05）。適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后進行實驗，SHR組與Wistar組逐只交叉進行。

1.2 腸系膜集合淋巴管活體觀察方法

腹腔注射3%戊巴比妥鈉（3mg／100g）麻醉。左側(cè)頸動脈插管并連接生理記錄儀（MP－150，BⅠOPAC，美國）測量血壓。按照 Xiu等［17］的方法手術(shù)暴露腸系膜集合淋巴管后置于裝有攝像頭（KY－100，JⅤC， 日 本）的 活 體 顯 微 鏡 （ACM，ZEⅠSS，德國）觀察平臺上，采用37.5℃±0.2℃恒溫、pH 7.4±0.2的林格氏液持續(xù)灌流。靜息30min后進行自律運動的觀察。

1.3 自律運動視頻錄像、動態(tài)跟蹤測量

選擇持續(xù)自律運動的集合淋巴管區(qū)段進行連續(xù)錄像。必要時追加麻醉。所錄視頻以XⅤⅠD編碼器編碼后保存為AⅤⅠ格式文件，供回放觀察和測量分析。24位真彩色視頻圖像分辨率為720×576像素，RGB三通道，每通道256級灰度，PAL制式標準幀率25幀／s。使用基于改良的塊匹配相關(guān)算法的ⅤasTrack技術(shù)［16］對視頻中集合淋巴管目標位點的管徑動態(tài)變化進行連續(xù)跟蹤測量。處于自律運動狀態(tài)的淋巴管管徑變化表現(xiàn)為管徑沿時間軸方向的類周期性波形圖（圖1）。各例隨機選取其中15個連續(xù)完整的收縮／舒張循環(huán)（即一次自律運動）波形進行統(tǒng)計。依次計算單次自律運動過程的特征指標。

圖1 包含6次收縮／舒張循環(huán)的自律運動跟蹤測量結(jié)果局部波形示例圖

1.4 自律運動特征參數(shù)計算方法

各項特征指標的計算參見圖2及下述公式：（1）基本特征指標：相對振幅（RA＝ 收縮振幅／收縮前靜息期管徑）、收縮頻率（Freq＝每分鐘所完成的收縮循環(huán)的次數(shù)）；（2）運動力學(xué)特征指標：收縮振幅（As）、舒張振幅（AD）、收縮時長（Ts）、舒張時長（TD）、收縮速度（Ⅴs＝ As／Ts）、舒張速度（ⅤD＝ AD／TD）、收縮／舒張時長比（RS／D＝ Ts／TD）；（3）收縮活性指標［12］：收縮分數(shù)［F＝（收縮期起點管徑的平方－波谷管徑的平方）／收縮期起點管徑的平方］、收縮活力指數(shù)（Ⅰnd＝F×Freq）。

圖2 集合淋巴管自律運動中單次收縮／舒張循環(huán)基本參數(shù)定義示意圖

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，所有數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組自律運動基本特征比較

SHR組收縮頻率較Wistar組有所上升（14.20±6.00次／min vs 10.80±3.70次／min），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－1.61，P＞0.05），見圖3；兩組相對振幅差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（39.60%±16.50%vs 43.10%±14.90%，t＝0.54，P＞0.05），見圖4。

圖3 SHR組與Wistar組自律運動頻率

圖4 SHR組與Wistar組自律運動相對振幅

2.2 兩組自律運動力學(xué)特征比較

2.2.1 收縮振幅、舒張振幅：SHR組收縮振幅較Wistar組下降（38.40±15.00μm vs 48.60±19.30μm），舒張振幅也下降（37.70±14.90μm vs 47.60±19.10μm），但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為1.42和1.38，P 均＞0.05），見圖5。

圖5 SHR組與Wistar組自律運動收縮振幅、舒張振幅

2.2.2 收縮時長、舒張時長：SHR組和 Wistar組大鼠收縮時長（1.43±0.30vs 1.54±0.23）和舒張時長（2.33±0.90vs 2.64±0.84）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為0.95和0.84，P 均＞0.05），見圖6。

圖6 SHR組與Wistar組自律運動收縮時長、舒張時長

2.2.3 收縮速度、舒張速度：SHR組的收縮速度較Wistar組有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（28.10±12.00μm／s vs 32.60±13.50μm／s，t＝0.84，P＞0.05），舒張速度也有下降，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（18.70±9.60μm／s vs 20.40±9.70μm／s，t＝0.67，P＞0.05），見圖7。

圖7 SHR組與Wistar組自律運動收縮速度、舒張速度

2.2.4 收縮／舒張時長比：SHR組收縮／舒張時長比與Wistar組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.71±0.23vs 0.67±0.18，t＝－0.44，P＞0.05），見圖8。

圖8 SHR組與Wistar組自律運動收縮／舒張時長比

2.3 兩組自律運動收縮活性比較

SHR組收縮分數(shù)與Wistar差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.61±0.20vs 0.66±0.18，t＝0.58，P＞0.05），見圖9。SHR收縮活力指數(shù)雖較 Wistar組有所上升（8.62±4.27vs 6.93±2.64），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－1.13，P＞0.05），見圖10。

圖9 SHR組與Wistar組自律運動收縮分數(shù)

圖10 SHR組與Wistar組自律運動收縮活力指數(shù)

3 討 論

淋巴系統(tǒng)涉及脂類吸收與修飾、免疫、組織液回流、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等諸多方面［18］，其主要依托載體是淋巴液，處于淋巴管網(wǎng)絡(luò)體系外周的微淋巴管自律運動是主動泵取淋巴液并克服近心端阻力，推動淋巴液回流的主要動力來源［10］。微循環(huán)研究者于上世紀中后期已經(jīng)在微淋巴管的微觀結(jié)構(gòu)、功能和自律運動機制上取得了豐碩成果［19－21］。針對不同慢性病病理模型的微淋巴管自律運動變化及其潛在觸發(fā)機制研究成為當前研究的熱點［22，23］。Zawieja等［24］對代謝綜合征大鼠模型的腸系膜集合淋巴管自律運動模式的研究結(jié)果表明，使用高果糖飲食誘導(dǎo)7周后，SD大鼠腸系膜集合淋巴管發(fā)生了重塑，Ca2＋敏感性和淋巴管收縮功能下降，淋巴液輸出減少約50%。提示特定病理狀態(tài)下，集合淋巴管可能發(fā)生自律運動紊亂，并對體液循環(huán)有嚴重損害。但由于代謝綜合征模型是多種病理因素的“超級混合體”，不僅包括血壓升高，還包括血脂異常（甘油三酯升高和高密度脂蛋白膽固醇下降）、血糖升高和肥胖［25］，因而，無法了解其中單個因素（如血壓升高）與淋巴微循環(huán)功能紊亂之間的確切關(guān)系。為排除混雜因素的干擾，本研究選擇醫(yī)學(xué)界普遍認可的SHR進行集合淋巴管自律運動特征研究，單獨觀察血壓升高與微淋巴管自律運動模式的內(nèi)在聯(lián)系。

集合淋巴管在大鼠腸系膜上的存在方式多種多樣。大量脂肪組織和微血管不同程度與集合淋巴管的貼近或疊壓，可能對目標區(qū)段的管壁運動造成難以預(yù)料的物理限制。同時，一些比較彎曲的區(qū)段，以及緊鄰該區(qū)段上端、下端的匯合或分叉結(jié)構(gòu)，都可能產(chǎn)生不同程度的湍流。而且，微淋巴管管腔內(nèi)液體流態(tài)的任何微小變化都會直接引起剪切應(yīng)力的改變，進而被微淋巴管敏銳地感知，并作出調(diào)節(jié)（即“Flow－mediated Autoregulation”）［26］。所 以，為 了盡可能保證各組待測目標管段所處基本物理條件的一致性，減少結(jié)果誤差，本研究所選取的淋巴管目標區(qū)段均較平直，上端無匯合，下端無分叉，具有瓣膜，脂肪組織堆塊和伴行的微血管均不直接緊貼管壁，無微血管跨壓，且處于連續(xù)自律運動中。測量位點均統(tǒng)一限定在瓣膜下游附近淋巴管直徑最大處。凡不滿足以上任一要求的淋巴管段均予排除，以降低誤導(dǎo)性結(jié)果出現(xiàn)的幾率。

檢測結(jié)果顯示，SHR組集合淋巴管自律運動各項特征指標與Wistar組相比變化較大者包括收縮頻率（增加31.50%）、收縮速度（降低13.80%）、收縮振幅（減小21.00%）、舒張振幅（減小20.80%）、收縮活力指數(shù)（上升24.40%），其余指標變化均在±10%以內(nèi)。上述指標的組間差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但SHR組的微小變化對分析微淋巴管自律運動還是有積極的提示作用。運動力學(xué)特征指標如收縮速度、收縮振幅、舒張振幅的下降可以反映SHR微淋巴管的收縮力已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的減弱；收縮頻率增加則可以理解為SHR經(jīng)此方式代償，由于收縮力減弱所導(dǎo)致的輸出能力的下降。收縮活性指標中微淋巴管收縮分數(shù)的定義本質(zhì)上類似于心臟的射血分數(shù)，用于近似估計每次收縮循環(huán)的淋巴液搏出量。本實驗中兩組收縮分數(shù)基本相同，但是單位時間內(nèi)總搏出量（即收縮活力指數(shù)）在SHR組有所升高，收縮頻率的代償性增加可能是其原因之一。因為淋巴液高效的逆壓力梯度搏出不僅依靠管壁的強烈收縮，同時還高度依賴瓣膜的協(xié)同開閉［18，27］，所以瓣膜開閉運動與管壁舒縮運動的協(xié)調(diào)性直接決定淋巴液凈輸出量。

3周齡SHR處在高血壓發(fā)展的初期階段，其淋巴微循環(huán)只表現(xiàn)出些許變化，尚未出現(xiàn)功能障礙，應(yīng)在可調(diào)控范圍。體外研究表明，多種血管活性因子，如一氧化氮供體、前列腺素類、血栓素等，不僅對血管具有調(diào)節(jié)作用，亦能作用于微淋巴管上的同型受體，對淋巴管的自律收縮運動具有強烈的調(diào)節(jié)作用［6，28，29］。我們將進一步在體研究血管活性因子對微淋巴管自律運動的調(diào)節(jié)作用，并系統(tǒng)闡明高血壓持續(xù)發(fā)展過程中淋巴微循環(huán)自律運動模式的轉(zhuǎn)換，為探索淋巴微循環(huán)與高血壓發(fā)展機制提供更全面的實驗依據(jù)。