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        NGF重組腺病毒在螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中的轉(zhuǎn)染特性

        2015-05-21 10:06:28宋武戰(zhàn)范泉水張學(xué)淵游建軍
        西南國防醫(yī)藥 2015年11期
        關(guān)鍵詞:胞體貼壁離體

        池 君,宋武戰(zhàn),范泉水,張學(xué)淵,劉 丹,游建軍

        研究表明,螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中存在著微量的神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF),其細胞中亦分布著NGF的高效受體TrkA[1-2],NGF要通過與其受體TrkA結(jié)合,啟動細胞內(nèi)的信號途徑而發(fā)揮保護神經(jīng)元、促進神經(jīng)元存活等作用。由于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion neurons,SGNs)在聽覺損傷和恢復(fù)中發(fā)揮重要作用,如何利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高細胞中NGF含量,使SGNs能在耳蝸內(nèi)長期存活,將為感音神經(jīng)性耳聾的基因治療提供新的途徑。本實驗將外源性NGF通過腺病毒導(dǎo)入SGNs中,觀察轉(zhuǎn)染后SGNs的變化和存活時間。

        1 材料與方法

        1.1 動物及材料 選用出生后3 d健康的SD大鼠10只(20耳)(購自昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,許可證號SYXK2005-0004),雌雄不限。隨機分成兩組,每組5只(10耳)。A組為NGF重組腺病毒轉(zhuǎn)染組,B組為非轉(zhuǎn)染組。攜帶有小鼠NGF基因的重組腺病毒制備參考文獻[3]。

        1.2 腺病毒轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞 耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的分離、培養(yǎng)參考文獻[4]。A組中,當螺旋神經(jīng)節(jié)細胞培養(yǎng)至第 時,將 孔板中原有的培養(yǎng)液吸出一半,加入500 μl腺病毒液;37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,再加入新的細胞培養(yǎng)液;48 h后半量換液;B組不加入病毒液,培養(yǎng)同前。每天觀察細胞形態(tài)和熒光變化,兩組細胞均培養(yǎng)14 d。

        1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染前后SGNs中NGF的變化 終止培養(yǎng)后,A、B兩組分別行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。按常規(guī)制備10%的SDS-PAGE凝膠,上樣后電泳,5%積層膠中電壓為80 V,樣品進入分離膠后電壓調(diào)至120 V;電泳完畢后,將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上。麗春紅染色觀察是否有蛋白質(zhì)條帶,然后進行下一步操作。封閉1 h,孵育兔抗鼠多克隆抗體NGF(一抗)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),稀釋倍數(shù)1∶500,4℃過夜;TBST液漂洗3次,15 min/次,浸入含HRP標記的羊抗兔IgG (北京中山生物技術(shù)有限公司,1∶1000)的二抗中,37℃ 1 h,TBST液漂洗3次,15 min/次, 化學(xué)發(fā)光法顯影,X膠片記錄結(jié)果。

        2 結(jié)果

        2.1 B組離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞 在分離培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中,種植后24 h,可見6孔板底部有細胞貼壁,此時細胞突起短,隨著培養(yǎng)時間的延長,突起逐漸長出。培養(yǎng)第5 d,可見SGNs胞體多呈橢圓形,胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈,胞體邊緣光滑,細胞透明,胞漿均質(zhì),折光性好。細胞突起細長,突起的長度一半大于胞體直徑的2~3倍,可見軸漿多處局部膨起,少數(shù)細胞的突起相互交織(圖1)。培養(yǎng)第10 d,部分細胞突起消失,胞體呈不規(guī)則形,貼壁差,少數(shù)細胞漂浮在培養(yǎng)液中(圖2)。培養(yǎng)至第14 d時,多數(shù)細胞漂浮,細胞崩解死亡。

        2.2 A組離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞 培養(yǎng)開始至加入腺病毒前,SGNs的形態(tài)同B組。重組腺病毒轉(zhuǎn)染SGNs后第2 d(即培養(yǎng)5 d),倒置顯微鏡下可見SGNs貼壁良好,熒光顯微鏡下可見部分細胞胞體和突起發(fā)出熒光,強度較弱(圖3);第5 d(即培養(yǎng)8 d),約有80%~90%的細胞發(fā)出熒光,強度增強,細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,貼壁良好,許多細胞的突起交織成網(wǎng)(圖 4)。 第 11 d(即培養(yǎng) 14 d),約 50%細胞仍有熒光發(fā)出,半數(shù)細胞貼壁良好(圖5)。分別對離體培養(yǎng)10 d的兩組SGNs計數(shù),B組細胞較A組顯著減少(P < 0.05)。

        圖1 離體培養(yǎng)5 d的SGNs(×100)

        圖2 離體培養(yǎng)10 d的SGNs(×100)

        圖3 重組腺病毒轉(zhuǎn)染第2 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達(×100)

        圖4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染第5 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達(×200)

        圖5 重組腺病毒轉(zhuǎn)染第11 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達(× 200)

        2.3 兩組NGF在SGNs中的表達 重組腺病毒轉(zhuǎn)染A組后,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測兩組的NGF含量,結(jié)果A組的NGF總蛋白灰度值的均數(shù)為 0.718 24±0.036 92,顯著高于 B 組的 0.243 58±0.007 58(P < 0.01,圖 6),提示轉(zhuǎn)染后 A 組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞中NGF的含量高。

        圖6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測NGF在SGNs中的表達左側(cè)B組;右側(cè)A組

        3 討論

        迄今已有多種體系的真核表達載體,生物載體以缺陷型病毒表達載體為主,利用病毒對動物細胞的天然感染力,將目的基因表達單位成功導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)。螺旋神經(jīng)節(jié)細胞屬終末分化的神經(jīng)元細胞,腺病毒是一種雙鏈、無包膜DNA病毒,宿主范圍廣,可感染人體多種組織細胞,包括分裂期和非分裂期細胞(如神經(jīng)細胞和心肌細胞),在基因治療的研究中,其轉(zhuǎn)染效率和安全性日益提高和完善[5-6]。本實驗發(fā)現(xiàn),腺病毒轉(zhuǎn)染SGNs后第2 d,部分細胞胞體和突起發(fā)出熒光,提示腺病毒進入細胞內(nèi)并開始表達目的基因。轉(zhuǎn)染第5 d,多數(shù)細胞感染病毒并發(fā)出較強熒光。轉(zhuǎn)染第11 d,部分細胞熒光轉(zhuǎn)弱甚至消失,顯微鏡下示細胞突起變短、崩解,漂浮,不貼壁。表明腺病毒能順利進入生長良好的SGNs細胞并在其中表達目的基因,表達時間約14 d左右,這為外源基因干預(yù)離體SGNs細胞的途徑提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

        神經(jīng)生長因子是一種高效多能的神經(jīng)營養(yǎng)因子,廣泛存在于動物體內(nèi),由 種亞基 按α2βγ2的排列組成,其中只有β亞基具有生物學(xué)作用。在神經(jīng)元發(fā)育成熟期,具有維持感覺神經(jīng)元和中樞神經(jīng)元群的功能、促進成熟神經(jīng)元軸索分支等作用。研究表明,NGF對神經(jīng)嵴起源的耳蝸-橄欖束具有誘向和營養(yǎng)作用。Lefebvre等[7]觀察到,外源性NGF能促進離體培養(yǎng)的SGNs軸突延長。Staecker等[8]認為,NGF及其受體不僅影響出生后耳蝸神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)支配的分布,而且對于防護受損神經(jīng)元的變性具有一定的潛能。本實驗中,在培養(yǎng)第72 h通過腺病毒將NGF導(dǎo)入SGNs,觀察到轉(zhuǎn)染第2 d(即培養(yǎng)第5 d)綠色熒光蛋白即在某些細胞中表達,發(fā)出熒光的神經(jīng)元貼壁良好,軸突長,細胞的形態(tài)與非轉(zhuǎn)染組比較沒有明顯差別。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,發(fā)出熒光的細胞數(shù)不斷增多,熒光表達也逐漸增強,同對照組相比,神經(jīng)元的胞體較大,軸突明顯延長,許多細胞的軸突相互交織成網(wǎng),提示導(dǎo)入SGNs中的NGF刺激了胞體和突起的生長。

        Kromer[9]切斷SD大鼠雙側(cè)腦中隔到背部海馬的所有膽堿能神經(jīng)纖維,制成腦損傷模型,然后向腦內(nèi)注入NGF或細胞色素C,2 w后測定神經(jīng)元存活率,結(jié)果細胞色素C組僅18%,而NGF組為84%,比對照組升高3.5倍,故認為在各種中樞神經(jīng)損傷后應(yīng)用外源性NGF可維持神經(jīng)元生存。本實驗觀察了在正常培養(yǎng)條件下NGF對SGNs生存時間的影響,結(jié)果培養(yǎng)第11 d,SGNs細胞貼壁良好,形態(tài)正常;培養(yǎng)第14 d,轉(zhuǎn)染組仍有50%SGNs發(fā)出熒光,細胞貼壁良好,細胞的形態(tài)沒有明顯改變,交織成網(wǎng)的突起也沒有回縮。而非轉(zhuǎn)染組中培養(yǎng)的SGNs在培養(yǎng)第10 d時即有部分細胞突起消失,胞體變形甚至死亡;培養(yǎng)第14 d時大多數(shù)細胞胞體已經(jīng)變形,突起縮短甚至消失,多數(shù)細胞胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡,胞體崩解。從培養(yǎng)存活的時間上,可以初步推測NGF對離體培養(yǎng)的SGNs存活具有促進作用。

        本實驗將攜帶有NGF基因的腺病毒轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞,病毒成功進入細胞并表達目的基因,被轉(zhuǎn)染的細胞存活時間延長,為離體SGNs的保護研究提供了一條可行的途徑。

        [1]池君,張學(xué)淵,宋武戰(zhàn).豚鼠耳蝸不同發(fā)育階段神經(jīng)生長因子的分布及其意義[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,42(5):386-387.

        [2]CF Dai,PS Steyger,ZM Wang,et al.Expression of Trk A receptors in the mammalian inner ear[J].Hear Res,2004,187(1):1-11.

        [3]池君,張學(xué)淵,宋武戰(zhàn).小鼠神經(jīng)生長因子基因重組腺病毒的構(gòu)建及其在基底膜上的表達 [J].中華耳科學(xué)雜志,2007,5(2):207-211.

        [4]池君,宋武戰(zhàn),范泉水,等.耳螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的培養(yǎng)及重組腺病毒在細胞中的表達[J].西南國防醫(yī)藥,2013,23(4):349-351.

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        [7]Lefebvre PP,Van de Water TR,Staecker H,et al.Nerve growth factor stimulates neurite regeneration but not survival of adult auditory neurons in vitro[J].Acta Otolaryngol,1992,112(2):288-293.

        [8]Staecker H,Li D,Malley BW,et al.Gene expression in the mammalian cochlea:a study of multiple vector systems[J].Acta Otolaryngology,2001,121(2):157-163.

        [9]Kromer LF.Nerve growth factor treatment after brain injury prevents neuronal death[J].Science,1987,235(4785):214-216.

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