李 麗，尉 莉，馬 琳

β受體阻滯劑對體外培養(yǎng)血管內皮細胞增生及凋亡的影響

李 麗，尉 莉，馬 琳

李 麗

目的 了解普萘洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾對體外培養(yǎng)的血管內皮細胞增生及凋亡的影響。方法 對人臍靜脈血管內皮細胞進行體外培養(yǎng)，分別加入9種濃度的4種藥物，設立陰性及陽性對照，采用cell counting kit-8（CCK-8）法檢測細胞增生，Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。結果 ①同一藥物不同濃度之間抑制率比較：普萘洛爾和阿替洛爾結果一致，各個濃度之間抑制率P均＜0.05；醋丁洛爾和噻嗎洛爾結果一致，3.125 μmol/L與12.5 μmol/L及12.5 μmol/L與50 μmol/L抑制率P均＞0.05，其余濃度間抑制率P均＜0.05。②同一濃度的不同藥物之間抑制率比較：在200、100、50 μmol/L 3種濃度時，普萘洛爾與阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾抑制率比較P均＜0.05，后3種藥物抑制率比較P均＞0.05；在25 μmol/L濃度時，普萘洛爾與醋丁洛爾抑制率比較P均＜0.05；其余藥物抑制率比較P均＞0.05。在12.500、6.250、3.125、1.562 5、0.781 3 μmol/L這5種濃度中，同一濃度的不同藥物抑制率比較P均＞0.05。③對細胞凋亡的誘導：普萘洛爾、阿替洛爾與陰性對照組凋亡率比較P均＜0.05；阿替洛爾、普萘洛爾、醋丁洛爾和噻嗎洛爾與二氯化鈷組凋亡率比較P均＜0.05；而阿替洛爾、普萘洛爾、醋丁洛爾和噻嗎洛爾4種藥物凋亡率比較P均＞0.05。結論 4種藥物均可抑制細胞增生，普萘洛爾作用最強，且隨著藥物濃度增加抑制作用也明顯增強；4種藥物均可誘導細胞凋亡，但彼此之間無明顯差異。

β受體阻滯劑；增生，人臍靜脈血管內皮細胞；血管瘤

[J Pract Dermatol, 2015, 8(6):411-414]

嬰兒血管瘤是嬰兒期最常見的良性腫瘤，由胚胎期間的血管組織增生而形成，以血管內皮細胞異常增生為特點，發(fā)生在皮膚和軟組織的良性腫瘤。自從2008年Léauté-Labrèze[1]發(fā)現(xiàn)普萘洛爾對嬰兒血管瘤有很好的療效后，已有臨床隨機對照研究證明普萘洛爾治療嬰兒血管瘤安全而有效[2]。目前，普萘洛爾已成為治療高風險級別嬰兒血管瘤的一線藥物[3]。由于普萘洛爾為非選擇性β1及β2受體阻滯劑，其β1受體阻斷作用可引起心率減慢、低血壓，β2受體阻斷可誘發(fā)支氣管平滑肌收縮和支氣管哮喘，另外還可能引起低血糖等不良反應。故已有學者在臨床上嘗試使用其他β受體阻滯劑，如阿替洛爾為選擇性β1受體阻滯劑，用于對普萘洛爾耐受性較差的血管瘤患兒，取得了很好的療效，且不良反應較少[4]。醋丁洛爾為選擇性β1受體阻滯劑，也具有一定的內源性擬交感活性，可以減少對心臟的抑制作用，臨床應用更安全。有研究報道，口服普萘洛爾治療血管瘤停藥后復發(fā)，采用醋丁洛爾取得了良好的療效，并且未見明顯的不良反應[5]。同時已有大量文獻報道外用噻嗎洛爾治療淺表型嬰兒血管瘤取得了很好的療效[6]。

盡管有大量臨床研究報道[7]，但關于這4種β受體阻滯劑在抑制細胞增生及誘導細胞凋亡方面的作用有無差別尚不清楚。本研究擬通過體外人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells , HUVEC）培養(yǎng)、加入100 μmol/L二氯化鈷對細胞進行刺激后使其迅速增生，從而模擬體內血管瘤內皮細胞增生模式，觀察不同濃度普萘洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾干預下HUVEC的增生及凋亡。

1 資料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株 HUVEC由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。完全培養(yǎng)基為90% RPMI-1640+10% FBS，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗細胞加入100 μmol/L二氯化鈷進行刺激24 h，使其迅速增生；陰性對照細胞不加入二氯化鈷及藥物，陽性對照細胞只加入二氯化鈷，不加入藥物。1.1.2 主要試劑 普萘洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾、噻嗎洛爾、二氯化鈷、青霉素/鏈霉素溶液、0.25% Tripsin-EDTA（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），RPMI-1640（美國 GIBCO），F(xiàn)BS（美國ExCell Biology），cell counting Kit-8（日本 DOJINDO Laborataries），LDH 試劑盒，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.1.3 主要儀器與設備 超凈工作臺（蘇州凈化 SWCJ-1FD），CO2培養(yǎng)箱（日本 SANYO XD-101），生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS Ⅸ51），臺式低速離心機（上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設備廠80-2），酶標儀（美國BioTek ELx800），流式細胞儀（美國 Becton-Dickinson FACS Calibur）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細胞增生 細胞消化、計數(shù)，配制成濃度為5×104個/ml的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細胞懸液；用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入200 μl相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組及陽性對照組；將96孔板每孔加入10 μl CCK-8，進行CCK-8染色，λ=450 nm，測定A值；計數(shù)各組的抑制率，抑制率(%)=(陰性對照組－試驗組)÷陰性對照組×100%。

1.2.2 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期的細胞消化接種到6孔板中，次日待細胞貼壁后，根據(jù)組別設置加入相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組；藥物作用24 h后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細胞；用PBS洗滌細胞2次（離心2 000 r/min，共5 min）收集5×105細胞；加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl propidium iodide，混勻；室溫，避光，反應5～15 min；用流式細胞儀檢測（Ex=488 nm；Em=530 nm）細胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計學方法

計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及卡方檢驗，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度β受體阻滯劑作用于血管內皮細胞24 h后對細胞增生的影響（表1）

2.1.1 不同濃度β受體阻滯劑對血管內皮細胞的抑制作用 9個濃度組的普萘洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾均對增生的血管內皮細胞有一定的抑制作用，隨著濃度的增加，抑制率逐漸上升，濃度越高，對細胞增生的抑制作用越強，具有劑量依賴抑制關系。2.1.2 同一濃度的不同藥物之間抑制率比較 在200、100、50 μmol/L 3種濃度時，均表現(xiàn)為普萘洛爾抑制作用最強，與阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾的抑制作用比較差異均有統(tǒng)計學意義，后三者之間抑制率無明顯差異。在25 μmol/L濃度時，普萘洛爾與醋丁洛爾抑制率之間差異有統(tǒng)計學意義。在12.5、6.25、3.125、 1.562 5、0.781 3 μmol/L這5種濃度中，同一濃度的不同藥物之間抑制率差異均無統(tǒng)計學意義。

2.1.3 二氯化鈷對血管內皮細胞的刺激作用 二氯化鈷作為陽性對照，7個濃度組的二氯化鈷對血管內皮細胞有一定的刺激增生作用，隨著濃度的增加，刺激率逐漸上升，具有劑量依賴刺激關系。

2.2 不同濃度β受體阻滯劑及二氯化鈷作用于血管內皮細胞24 h后對細胞凋亡的影響

流式儀檢測結果顯示，陰性對照組細胞凋亡率為8.40%，100 μmol/L二氯化鈷凋亡率為5.86%，200 μmol/L阿替洛爾凋亡率為18.50 %，200 μmol/L普萘洛爾凋亡率為18.57 %，醋丁洛爾 200 μmol/L凋亡率為15.08 %，噻嗎洛爾 200 μmol/L凋亡率為17.05 %。與陰性對照組比較，阿替洛爾和普萘洛爾與陰性對照組的細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義；與二氯化鈷組比較，阿替洛爾、普萘洛爾、醋丁洛爾和噻嗎洛爾與二氯化鈷組的細胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義；而阿替洛爾、普萘洛爾、醋丁洛爾和噻嗎洛爾4種藥物之間的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（圖1）。

表1 不同濃度β受體阻滯劑作用24 h對二氯化鈷誘導后的內皮細胞增生的影響 （±s）

表1 不同濃度β受體阻滯劑作用24 h對二氯化鈷誘導后的內皮細胞增生的影響 （±s）

注：普萘洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾4種藥物同一濃度之間比較結果：與普萘洛爾組比較，*P＜0.05；與阿替洛爾組比較，★P＜0.05；與醋丁洛爾組比較，■P＜0.05。相同藥物不同濃度比較：與陰性組比較，▲P＜0.05；與0.781 3 μmol/L組比較，◆P＜0.05，與3.125 μmol/L組比較，☆P＜0.05；與12.5 μmol/L組比較，◇P＜0.05；與50 μmol/L組比較，△P＜0.05

濃度(μmol/L )普萘洛爾 阿替洛爾 醋丁洛爾 噻嗎洛爾 二氯化鈷實際（A值） 抑制率（%） 實際（A值） 刺激增生率（%）200 0.591±0.017▲◆☆◇△51.94 0.915±0.013*▲◆☆◇△30.23 0.876±0.025*▲◆☆◇△28.70 0.812±0.012*▲◆☆◇24.43 1.347±0.05 11.51 100 0.713±0.01 41.99 0.954±0.002* 27.31 0.931±0.013* 24.27 0.829±0.011*22.84 1.395±0.041 15.45 50 0.816±0.011▲◆☆◇33.60 1.042±0.007*▲◆☆ 20.58 0.996±0.026*▲◆☆◇18.99 0.855±0.027*▲◆☆◇20.36 1.371±0.008 13.52 25 0.951±0.027 22.59 1.086±0.048 17.25 1.052±0.04*14.40 0.907±0.023 15.58 1.357±0.003 12.31 12.5 1.012±0.015▲◆☆17.66 1.098±0.01▲◆☆16.34 1.096±0.025▲◆10.79 0.961±0.025▲◆10.52 1.276±0.019 5.60 6.25 1.075±0.033 12.50 1.165±0.016 11.20 1.108±0.013 9.82 0.982±0.021 8.57 1.245±0.003 3.06 3.125 1.126±0.043▲8.38 1.216±0.023▲7.29 1.132±0.027▲7.89 0.997±0.025▲7.20 1.233±0.006 2.10 1.562 5 1.156±0.018 5.94 1.232±0.03*6.12 1.186±0.033 3.53 1.012±0.01 5.74 0.781 3 1.169±0.033 4.88 1.252±0.034 4.60 1.222±0.052 0.60 1.023±0.019 4.72陰性對照組 1.216±0.036 0 1.302±0.053 0 1.229±0.059 0 1.074±0.051 0 1.208±0.006 0 （%） 實際（A值） 抑制率（%） 實際（A值） 抑制率（%） 實際（A值） 抑制率

圖1 β受體阻滯劑及二氯化鈷作用于血管內皮細胞24 h后對細胞凋亡的影響

3 討論

普萘洛爾目前被認為是治療重癥嬰兒血管瘤的一線藥物[3]。雖然其療效確切，但機制仍未明了。有學者發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾可以通過低氧誘導性因子-1α-血管內皮生長因子-A (HIF-1α-VEGF-A)軸發(fā)揮其對血管瘤的抑制作用，普萘洛爾引起HIF-1α通路抑制血管瘤內皮細胞VEGF-A的表達[8]。另外，信號肽介導通路包括PI3/Akt和p38/MAPK，能減少內皮細胞的遷移、血管發(fā)生和最終的凋亡，最后直接引起細胞毒性效應。Tazi等[9]研究得出普萘洛爾能使內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活性和表達分別降低47%和75%，低水平的eNOS能直接降低一氧化氮(nitric oxide, NO)的產生，從而導致血管收縮和降低血管緊張度。另外，eNOS的降低能減少血管瘤內皮細胞的增生和長期控制血管瘤增生。另有研究顯示，普萘洛爾可通過抑制血管內皮細胞由G0期向G1期的轉變而導致細胞周期停滯，并可抑制內皮細胞遷移、分化成毛細血管樣管狀結構，從而抑制血管生成[10]。故本藥在增生期及消退期均可能對血管瘤有治療作用。以上的發(fā)現(xiàn)初步闡述了普萘洛爾治療嬰兒血管瘤的可能機制，也為今后應用普萘洛爾及其他β受體阻滯劑治療嬰兒血管瘤機制的進一步深入研究打下了良好的基礎。同時也有學者在嘗試使用其他β受體阻滯劑治療嬰兒血管瘤，如阿替洛爾、醋丁洛爾、噻嗎洛爾等，均取得了一定的療效。但不同的β受體阻滯劑在抑制細胞增生及促進凋亡方面是否存在差異，以及藥物濃度與增生和凋亡的相關性尚無理論基礎。

本研究采用體外血管內皮細胞培養(yǎng)，加入不同濃度、不同種類的β受體阻滯劑，觀察其24 h對血管內皮細胞的增生抑制情況及促進凋亡情況。發(fā)現(xiàn)在普萘洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾這4種β受體阻滯劑中，均表現(xiàn)為抑制血管細胞的增生，這與臨床中所見到的抑制瘤體增生情況是一致的。其中，普萘洛爾抑制細胞增生的作用明顯高于其他3種藥物，尤其在高濃度時這種差距更明顯，這也從體外試驗角度證明普萘洛爾療效較其他藥物更好。而對于同一種β受體阻滯劑不同濃度的抑制作用而言，濃度越高，抑制作用越強，這與臨床研究中普萘洛爾治療血管瘤的劑量依賴關系是符合的，即口服普萘洛爾劑量越大，療效越好[2]。其余3種藥物尚無劑量比較的臨床研究，根據(jù)體外試驗的結果，可考慮它們也有一定的劑量依賴性。此項研究提示噻嗎洛爾在高濃度時（50 μmol/L和200 μmol/L），其抑制細胞增生程度之間無統(tǒng)計學差異。臨床應用中噻嗎洛爾主要為外用制劑，治療淺表性血管瘤的噻嗎洛爾外用制劑中有0.1%[11]，0.25%[12 ]及0.5%[13]3種濃度。關于濃度與療效的關系，體外試驗已經提示噻嗎洛爾抑制細胞增生的程度并未隨著藥物濃度增加而增強，是否臨床應用的3種濃度療效存在差異，尚需進一步臨床研究證實。如果體外研究與臨床研究結果相吻合，則外用低濃度的噻嗎洛爾即達到良好的治療效果，可避免濃度增加帶來的不良反應。

既往研究報道，普萘洛爾作用于血管內皮細胞24 h后即可誘導其凋亡[14]，這與本研究中普萘洛爾對血管內皮細胞的誘導凋亡情況是一致的。關于其他β受體阻滯劑對血管內皮細胞的誘導凋亡的情況尚未見報道。根據(jù)本研究結果顯示，在誘導內皮細胞凋亡方面，阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾均可誘導血管內皮細胞凋亡，且誘導細胞凋亡在用藥后24 h即可出現(xiàn)，這與臨床中應用β受體阻滯劑治療血管瘤早期即可見瘤體顏色變淺或質地變軟相吻合[15]。但4種藥物之間誘導細胞凋亡率相比，并未見差異。

綜上所述，普萘洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾及噻嗎洛爾4種不同的β受體阻滯劑對血管內皮細胞均有一定的抑制作用。在抑制細胞增生方面，普萘洛爾作用最強，且隨著藥物濃度增加抑制作用越明顯；在誘導細胞凋亡方面，4種藥物也均有作用，但彼此之間未見差別。由于β受體阻滯劑治療血管瘤的機制復雜，本研究只是探討了其中一部分，其余尚有相關血管生成因子如VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），細胞循環(huán)中的周期蛋白等變化與血管瘤消退的關系，尚需今后進一步研究證實。

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（本文編輯 耿建麗）

The effect of β-blockers on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells in vitro culture

LI Li，WEI Li，MA Lin
Department of Dermatology, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China

Objective To observe the influence of propranolol, atenolol, acebutolol and timolol on the proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells in vitro culture. Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro. Four kinds of the drugs, each with 9 different concentrations and the negative and positive control were added. Cell counting Kit-8 (CCK-8) method was used to detect cell proliferation and annexin-V FITC/PI double staining method was used to detect cell apoptosis. Results The inhibition rate between different drug concentrations of one drug: all concentrations of propranolol and atenolol presented significant difference (P＜0.05) of the inhibition rate between each other. With the concentrations of 3.125 μmol/L and 12.5 μmol/L, 12.5 μmol/L and 50 μmol/L of acebutolol and timolol both presented significant difference (P＜0.05) of the inhibition rate between each other. The other concentrations of acebutolol and timolol both presented no significant difference (P＜0.05) of the inhibition rate between each other. Inhibition rates between different drugs of the same concentration: with the concentrations of 200 μmol/L, 100 μmol/L and 50 μmol/L, inhibition rates of propranolol group was significantly higher than that of atenolol group, acebutolol group and timolol group (P＜0.05), the inhibition rates of atenolol group, acebutolol group and timolol group had no significantly differences between each other (P＞0.05). With the concentrations of 25 μmol/L, inhibition rates of propranolol group was significantly higher than that of acebutolol group (P＜0.05), other drug groups had no significant differences between each other (P＞0.05). With the concentrations of 12.5 μmol/L, 6.25 μmol/L, 3.125 μmol/L, 1.5625 μmol/L and 0.7813 μmol/L, inhibition rates of propranolol group, atenolol group, acebutolol group and timolol group had no significant differences between

R732.23

A

1674-1293(2015)06-0411-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150603

100045 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科（李麗，尉莉，馬琳）

李麗，主治醫(yī)師，研究方向：嬰兒血管瘤及血管畸形的臨床及基礎研究，E-mail: luckylili@126.com通訊作者：馬琳，E-mail: bch_maleen@aliyun.comeach other (P＞0.05). The apoptosis rate of human umbilical vein endothelial cells: the apoptosis rate of propranolol group and atenolol group were both significantly higher than that of negative group (P＜0.05); the apoptosis rate of propranolol group, atenolol group, acebutolol group and timolol group were all significantly higher than that of cobalt dichloride group (P＜0.05); the apoptosis rate of propranolol group, atenolol group, acebutolol group and timolol group had no significant differences between each other (P＞0.05). Conclusion Four kinds of β-blockers can inhibit human umbilical vein endothelial cells proliferation, propranolol has the strongest effect, the higher concentration, the better effect. Four kinds of β-blockers can induce human umbilical vein endothelial cells apoptosis, however, there were no significantly differences between each other.

2015-07-20

2015-09-26）