范凌曄，石磊，詹平，劉玲，聶丹，毛熙光

論著

中電導(dǎo)鈣激活鉀通道（IKCa通道）在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖的影響*

范凌曄，石磊1，詹平，劉玲，聶丹，毛熙光

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：婦產(chǎn)科；1人力資源部，四川瀘州646000）

目的：本研究旨在探討中電導(dǎo)鈣激活鉀通道（IKCa通道）在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖的作用。方法：以宮頸癌HeLa細(xì)胞株為研究對象，構(gòu)建包含IKCa通道特異性shRNA片段的pGenesil-IK質(zhì)粒；運(yùn)用熒光定量PCR和Western Blotting比較pGenesil-IK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染干預(yù)前后宮頸癌HeLa細(xì)胞中IKCa通道基因和蛋白表達(dá)水平的變化；運(yùn)用WST-1檢測技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后對HeLa細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：①轉(zhuǎn)染pGenesil-IK干擾質(zhì)粒后HeLa細(xì)胞IKCa通道m(xù)RNA及蛋白表達(dá)水平較對照組顯著降低（P＜0.05）。②轉(zhuǎn)染pGenesil-IK1干擾質(zhì)粒顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期（P＜0.05）。結(jié)論：宮頸癌HeLa細(xì)胞上有較高的IKCa通道表達(dá)，抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞株IKCa通道表達(dá)能有效抑制癌細(xì)胞增殖，提示IKCa通道可能是宮頸癌的治療靶點(diǎn)之一。

宮頸癌曰中電導(dǎo)鈣激活鉀通道曰RNA干擾曰細(xì)胞增殖

宮頸癌（cervical cancer）是一種嚴(yán)重危害婦女健康的全球性疾病，在婦科腫瘤中位居第二。目前針對宮頸癌發(fā)病以及浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全闡明[1]。我們知道細(xì)胞正常電生理結(jié)構(gòu)以及功能的改變往往導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至腫瘤的形成。作為鈣激活鉀離子通道家族成員之一的中電導(dǎo)鈣激活鉀通道（IKCa通道），在人體許多惡性腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，并參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[2-5]。然而IKCa通道是否參與宮頸癌的發(fā)生尚未見報(bào)道。故本研究觀察IKCa通道在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)及下調(diào)IKCa通道后對HeLa細(xì)胞增殖的影響，探討IKCa通道在宮頸癌發(fā)病中作用以及意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組和RNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)中的宮頸癌HeLa細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈。實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對照組（Control）：不轉(zhuǎn)染IKCa通道干擾質(zhì)粒的的HeLa細(xì)胞；陰性對照組：轉(zhuǎn)染含有亂序的對照干擾質(zhì)粒pGenesil-HK的HeLa細(xì)胞；pGenesil-IK1組和pGenesil-IK2組：分別轉(zhuǎn)染含有兩個不同的IKCa通道干擾序列的HeLa細(xì)胞。RNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建采用從GeneBank數(shù)據(jù)庫中搜索得到IKCa通道的基因序列（NM-002250），選擇設(shè)計(jì)兩條shRNA和一條隨機(jī)重排而成的陰性對照,所篩選出的基因靶序列1（1360-1380）模板為（GCCTGGATGTTCTACAAACAT）；靶序列2（1512-1532）模板（CAAGATGCACATGATCCTGTA）；陰性對照（GCCTGGATGTTCTACAAACAT），分別構(gòu)建shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒命名為pGenesil-IK1，pGenesil-IK2，pGenesil-HK（由上海吉凱公司合成）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含10%小牛血清RPMI-1640（Hyclone，美國）培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用脂質(zhì)體LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染細(xì)胞（Invitrogen，美國），轉(zhuǎn)染步驟按照操作說明書進(jìn)行。

1.2.2 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

采用Taqman探針法檢測IKCa通道基因表達(dá)。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物及TaqMan探針序列（由上海吉凱公司合成），如表1所示，以GAPDH作為內(nèi)參照基因。通過總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，之后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：模板cDNA 5μL，10×PCR Buffer 10 μL，25 mM MgCl25μL，2.5 mM 4 dNTP混合液8 μL、0.5μM上下游引物各1μL、Taq DNA Polymerse（5 U/μL）1μL、加H2O使總反應(yīng)體系為100μL；退火溫度為55℃。反應(yīng)循環(huán)數(shù)40個循環(huán)。

表1 Taqman法熒光定量PCR引物和探針序列

1.2.3 Western Blotting實(shí)驗(yàn)

蛋白的提取按凱基全蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行，測定蛋白濃度后，調(diào)整樣品濃度，每個泳道加入的總蛋白量為30μg。按照Western Blotting方法進(jìn)行，包括SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉。一抗（兔抗IKCa抗體，稀釋比例1∶1 000；小鼠抗GAPDH抗體，稀釋比例1∶20 000，北京依瑪博科技有限公司）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（分別羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗，稀釋比例為1∶5 000，北京依瑪博科技有限公司）室溫孵育1 h，之后顯影并進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4 細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

每組20孔，每個時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后21、45、69、93 h分別往每孔中加入10μL的WST-1繼續(xù)培養(yǎng)3 h，將96孔板置于搖床上搖動1 min，以充分混勻待檢測體系。使用用酶標(biāo)儀分別測定轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后各孔450 nm處吸光度值。計(jì)算同組處理樣品吸光度平均值，繪制細(xì)胞生長曲線，統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞一次（離心2000 r/min，5 min）調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ mL，用70%乙醇4℃固定24 h，染色前用PBS洗去固定液，加入100μL RNaseA 37℃水浴30 min，再加入碘化丙啶（PI）溶液400μL染色混勻，4℃避光30 min后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析。使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測分析。計(jì)算增殖指數(shù)（PI）%=（S+G2）/（G1+S+G2）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IKCa通道干擾質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞上的表達(dá)

IKCa通道干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞24 h后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果，如圖1所示。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)染后含有GFP標(biāo)簽的對照質(zhì)粒pGenesil-HK和IKCa通道干擾質(zhì)粒pGenesil-IK1均能在HeLa細(xì)胞上表達(dá)，具有較高的轉(zhuǎn)染效率（大于70%）。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pGenesil-IK2的結(jié)果與pGenesil-IK1結(jié)果類似。2.2 Q-PCR檢測HeLa細(xì)胞IKCa通道m(xù)RNA表達(dá)水平

圖1 IKCa通道干擾質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞上的表達(dá)（×200）

以未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞為對照組（Control），各處理組IKCa和內(nèi)參GAPDH的CT值、ΔCt值、ΔΔCt值（處理組ΔCt值-Control組ΔCt值）及倍數(shù)關(guān)系如表2所示。轉(zhuǎn)染48 h后，pGenesil-IK1組、pGenesil-IK2組、pGenesil-HK組、Control組的ΔCt分別為9.81± 0.28，9.40±0.80，8.79±0.28，7.93±0.29。pGenesil-IK1組、pGenesil-IK2組表達(dá)水平明顯低于pGenesil-HK組和Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。pGenesil-HK組與Control組IKCamRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），pGenesil-IK1組與pGenesil-IK2組IKCa mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 IKCa通道干擾質(zhì)粒對IKCa和GAPDH的CT，ΔCt和ΔΔCt的影響（n=3,x±s）

2.3 IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞IKCa蛋白表達(dá)的影響

IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞IKCa蛋白表達(dá)影響如圖2所示。從圖中可以看出，對照質(zhì)粒pGenesil-HK對HeLa細(xì)胞IKCa通道表達(dá)沒有明顯影響（P＞0.05）。而與對照組相比，干擾質(zhì)粒pGenesil-IK1和pGenesil-IK2均能明顯下調(diào)HeLa細(xì)胞IKCa通道蛋白表達(dá)水平。相對表達(dá)量分別由1.30±0.15（Control，n=5）下降到0.77±0.12（pGenesil-IK1，n=5）和0.74±0.13（pGenesil-IK2，n=5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而干擾質(zhì)粒pGenesil-IK1和pGenesil-IK2之間對IKCa通道蛋白表達(dá)量影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞IKCa蛋白表達(dá)的影響

2.4 IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞增殖的影響

在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用WST-1檢測轉(zhuǎn)染IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，各組細(xì)胞OD值呈進(jìn)行性升高，但是pGenesil-IK1組較pGenesil-HK組和HeLa細(xì)胞空白對照組（Control）升高幅度?。ㄒ姳?）。在24、48、72、96 h 4個時(shí)間點(diǎn)，pGenesil-IK1組細(xì)胞生長和增殖速度明顯減緩，與pGenesil-HK組和HeLa空白對照組細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而pGenesil-HK組和Control組在各個時(shí)段細(xì)胞增殖活性無明顯差異（P＞0.05），提示IKCa通道下調(diào)能有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

表3 WST-1檢測IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞增殖的影響（n=5,x±s）

2.5 IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，與HeLa細(xì)胞空白對照組（Control）和pGenesil-HK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，pGenesil-IK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，細(xì)胞被阻滯在G1期，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從表4中可以看出，Control組和pGenesil-HK組HeLa細(xì)胞G0/G1期比率分別是（48.8±0.2）%和（49.6±0.3）%，而pGenesil-IK1組G0/G1期為（53.0±1.8）%，與Control組和pGenesil-HK組相比，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Control組和pGenesil-HK組HeLa細(xì)胞S期比率是（31.5±1.5）%和（32.8±0.6）%，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-IK1組比率則分別為（28.6±0.9）%，與細(xì)胞對照組（HeLa）和pGenesil-HK組相比，S期細(xì)胞減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)PI發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染了pGensil-IK1質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞增殖指數(shù)為（45.0±1.8）%，而空白對照組（HeLa）和質(zhì)粒對照組（pGenesil-HK）增殖指數(shù)分別為（50.2 ±0.1）%，（49.3±0.4）%，與對照組細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些結(jié)果提示，表達(dá)IKCa通道shRNA重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染抑制了細(xì)胞增殖，使細(xì)胞生長停滯于G0/G1期。

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞周期的影響（%，n=5，x±s）

圖3 IKCa通道干擾質(zhì)粒對HeLa細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞檢測圖

3 討論

IKCa通道屬于鈣激活鉀通道家族成員之一，主要存在于一些非興奮性細(xì)胞中，參與細(xì)胞鈣離子內(nèi)流、膜電位、增生、凋亡和分泌等各種生理活動的調(diào)節(jié)[6-7]。IKCa通道的激活可導(dǎo)致細(xì)胞膜長期處于超極化狀態(tài)，形成細(xì)胞內(nèi)外電位差，這種電位差能促使對電位敏感的鈣離子通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，從而對細(xì)胞的功能產(chǎn)生的影響。研究提示IKCa通道功能的改變參與了包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生[8-9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，IKCa在乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲中有非常重要的作用[10-11]。上述的研究證實(shí)了IKCa通道在腫瘤中占有重要的地位和作用，在我們的研究中，我們運(yùn)用PCR和Western Blotting從基因和蛋白兩方面證實(shí)HeLa細(xì)胞中存在IKCa通道的表達(dá)，也為下一步研究其在宮頸癌中的作用和意義奠定基礎(chǔ)。

腫瘤細(xì)胞的增殖是腫瘤生長和侵襲的重要基礎(chǔ)，我們知道細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)，細(xì)胞周期的長短取決于G0/G1期的時(shí)間，G0/G1期時(shí)間越短，細(xì)胞的周期就越短，細(xì)胞增殖速度就越快。在人前列腺癌細(xì)胞研究中，Lallet-Daher等[11]發(fā)現(xiàn)，用IKCa的特異性阻斷劑TRAM-34阻斷IKCa可使細(xì)胞膜去極化，鈣離子內(nèi)流減少，細(xì)胞增殖周期減慢并停滯于G0/G1期；用IKCa的特異性阻斷劑TRAM-34及其靶向siRNA阻斷LNCaP和PC-3細(xì)胞的IKCa表達(dá)后，可導(dǎo)致細(xì)胞周期依耐性激酶抑制因子（CDKIS）p21Cip1蛋白蓄積。這些研究提示鉀離子通道通過調(diào)控癌細(xì)胞的生長周期進(jìn)程進(jìn)而調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡。目前，如何阻斷HeLa細(xì)胞的增殖過程，延緩宮頸癌的生長是目前研究宮頸癌的熱點(diǎn)[12]。在其他腫瘤中，使用TRAM-34或者RNA干擾阻斷IKCa表達(dá)后能顯著阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖。在本實(shí)驗(yàn)中，我們在檢測IKCa通道在HeLa細(xì)胞上表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過干擾技術(shù)敲除IKCa表達(dá)后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：敲低IKCa通道表達(dá)能使HeLa細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）明顯降低，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。隨后采用WST-1法分析發(fā)現(xiàn)在IKCa通道干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后HeLa細(xì)胞生長增殖受到了嚴(yán)重的抑制殖。然而對于其中的具體的分子機(jī)制我們將在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究中闡述。

綜上所述，宮頸癌HeLa細(xì)胞上有較高的IKCa通道表達(dá)，抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞株IKCa通道表達(dá)能有效抑制癌細(xì)胞增殖，提示IKCa通道可能是宮頸癌的治療靶點(diǎn)之一。

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（2015-01-13收稿）

Objective:To detect the expression of intermediate conductance calcium activated potassium channel in cervical cancer cell lines（HeLa）,and to observe the effect of blocking IKCachannels on cell proliferation and cycle.Methods：The plasmid of pGenesil-IK containing of IKCaspecific shRNA fragment channelwas transfected into HeLa cells.The combined use offluorescence quantitative PCR and Western blotting were used to investigate the gene and protein expression level of IKCachannels.The effect of IKCachannels on the proliferation of HeLa cells was investigated by WST-1 and flow cytometry.Results：①After transfection with the interference plasmid of pGenesil-IK1,IKCa channel mRNA and protein expression levels in the HeLa cells were lower than in the control group（P＜0.05）.②The cell cycle was inhibited by transfection with the interference plasmid of pGenesil-IK1（P＜0.05）.Conclusion:IKCachannels are highly expressed in cervical cancer HeLa cells.Inhibiting expression of IKCachannel can effectively inhibit,cell proliferation of HeLa cells, which suggested that IKCachannels may be one of the targets in the treatmentofcervical cancer.

Cervical cancer;Intermediate conductance calcium activated potassium channel；RNA interference;Cellproliferation

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.03.001

*四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（No:2008JY0014-1）

范凌曄（1978-），女，助教

毛熙光（196-），男，教授。E-mail：maoxiguang6639@163.com

Expression of intermediate conductance Ca2+-activated K+channels(IKCachannels)in HeLa cells and its role in cell proliferation

Fang Lingye,Shi Lei1,Zhan Ping,Liu Ling,Nie Dan,Mao Xiguang

Department of Gynaecology and Obstetrics;1Department of Human Resource，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College