白雪娟 梁艷 陽幼榮 王蘭 張翠英 張俊仙 吳雪瓊

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·論著·

卡介苗接種對酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測結(jié)核分枝桿菌感染的影響

白雪娟 梁艷 陽幼榮 王蘭 張翠英 張俊仙 吳雪瓊

目的 研究卡介苗(BCG)接種對采用重組培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)融合蛋白(重組CFP10-ESAT6融合蛋白)進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)檢測結(jié)核分枝桿菌感染的影響，評價ELISPOT診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的價值。方法 以結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗(yàn)為對照，應(yīng)用重組CFP10-ESAT6 融合蛋白進(jìn)行ELISPOT檢測105名2013年駐京部隊入伍新兵外周血中分泌結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6抗原特異性γ干擾素(IFN-γ)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)。對PPD和ELISPOT均為陰性的入伍新兵接種卡介苗，3個月后再做PPD試驗(yàn)和ELISPOT。應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 105名入伍新兵中，PPD試驗(yàn)和ELISPOT陽性率分別為59.0%(62/105)和14.3%(15/105)。43名PPD試驗(yàn)陰性和62例PPD試驗(yàn)陽性者中，分別有6例(14.0%)和9例(14.5%)ELISPOT陽性，兩種方法的檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.86，P=0.00)，兩種方法的一致率為43.8%(46/105)。35名PPD試驗(yàn)和ELISPOT檢測均為陰性的入伍新兵卡介苗接種3個月后，PPD試驗(yàn)陽轉(zhuǎn)率為37.1%(13/35)，而ELISPOT檢測均為陰性，接種前斑點(diǎn)數(shù)[(2.6±3.1)個]與接種后斑點(diǎn)數(shù)[(2.6±5.0)個]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.52，P=0.61)。結(jié)論 ELISPOT檢測結(jié)核分枝桿菌感染不受卡介苗接種的影響，能更真實(shí)地反映駐京部隊入伍新兵的結(jié)核潛伏感染情況。

潛伏性結(jié)核； 卡介苗； 接種； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定; 重組融合蛋白質(zhì)類

隨著結(jié)核病在全球的再次流行，結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)也日益受到重視。LTBI指宿主感染Mtb后的一種特殊狀態(tài)，感染者體內(nèi)Mtb處于持留狀態(tài)，未發(fā)生活動性結(jié)核病，但具有發(fā)展為活動性結(jié)核病的風(fēng)險。目前國內(nèi)外診斷Mtb感染的方法主要包括PPD試驗(yàn)[或稱結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)]及γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)[1-3]。國內(nèi)多采用PPD試驗(yàn)篩查LTBI，但是該方法存在許多缺點(diǎn)，如對于BCG接種過的人和非結(jié)核分枝桿菌感染者會出現(xiàn)假陽性，其特異度不高；對于免疫抑制者其敏感度也不高[4]。因此，部分發(fā)達(dá)國家及結(jié)核病低流行的國家已經(jīng)開始探討IGRA是否可以代替PPD試驗(yàn)檢測Mtb感染[5]；但在發(fā)展中國家和結(jié)核病高流行國家，例如處于高卡介苗接種率和Mtb高感染率背景下的中國，該技術(shù)的研究還處于初期，其應(yīng)用價值及穩(wěn)定性需要進(jìn)一步研究。在前期工作中筆者已成功地利用以Mtb特異性重組培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)融合蛋白(重組CFP10-ESAT6融合蛋白)作為刺激原的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme-linked immunospot, ELISPOT)方法檢測了駐京部隊?wèi)?zhàn)士的Mtb感染[6-7]。本研究采用該技術(shù)，進(jìn)一步研究BCG接種對該方法的影響，以探討該方法在廣泛接種卡介苗情況下的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、 一般資料

研究對象均來源于2013年北京某駐地入伍體檢的新兵，均為男性，共計105名，年齡18～21歲，平均(19.5±1.5)歲。胸部X線攝片檢查正常，無陳舊性結(jié)核病灶，無結(jié)核病相關(guān)的臨床癥狀及結(jié)核病病史，艾滋病病毒抗體檢查結(jié)果為陰性。并記錄有無卡痕。本研究經(jīng)解放軍第三〇九醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會論證，獲得批準(zhǔn)實(shí)施，受試者均知情同意。

二、主要試劑

TB-PPD購自北京祥瑞生物制品有限公司，卡介苗購自上海生物制品研究所，ELISPOT檢測試劑盒為上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測試劑盒(F-SPOT)。

三、PPD試驗(yàn)

采用Mantoux法在前臂皮內(nèi)注射標(biāo)準(zhǔn)TB-PPD 0.1 ml(50 IU/ml)，72 h檢查反應(yīng)結(jié)果，PPD試驗(yàn)結(jié)果由經(jīng)過正規(guī)預(yù)防接種培訓(xùn)的同一人員判讀，并記錄皮膚反應(yīng)硬結(jié)的平均直徑。若硬結(jié)平均直徑≥5 mm為陽性，≥15 mm為強(qiáng)陽性。

四、ELISPOT檢測

采集受試者靜脈血5 ml，置肝素鈉抗凝管輕輕顛倒混勻，于2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，4 h內(nèi)完成外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離。將收集到的靜脈血應(yīng)用淋巴細(xì)胞分層液，經(jīng)密度梯度離心法分離得到PBMC，計數(shù)并分別定量至2.5×106/ml。在已包被γ干擾素(IFN-γ)捕獲抗體的96孔孵育板內(nèi)分別加入50 μl細(xì)胞培養(yǎng)液(陰性對照)、陽性刺激物植物血凝素(PHA)、Mtb特異性抗原(重組CFP10-ESAT6融合蛋白)；每孔再加入100 μl定量后的細(xì)胞懸液，將微孔板放在含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h；培養(yǎng)結(jié)束后依次進(jìn)行細(xì)胞裂解、酶標(biāo)二抗孵育、生物素鏈親和素放大反應(yīng)、顯色及計算機(jī)掃描計數(shù)分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(簡稱斑點(diǎn)數(shù)，spot forming cells，SFCs)?？瞻卓變?nèi)斑點(diǎn)數(shù)<12個時，實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥13個，結(jié)果即為陽性；≥30個，結(jié)果即為強(qiáng)陽性；若空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥12個時，實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍空白孔斑點(diǎn)數(shù)，結(jié)果即為陽性。

五、BCG接種

在PPD試驗(yàn)及ELISPOT檢測陰性新兵的左上臂三角肌外下緣皮內(nèi)注射BCG 0.1 ml，含卡介菌0.05 mg(5人份/支)，3個月后第二次檢查PPD試驗(yàn)結(jié)果和進(jìn)行ELISPOT復(fù)查。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、入伍新兵PPD試驗(yàn)和ELISPOT檢測結(jié)果

105名入伍新兵中，PPD試驗(yàn)陽性62例(硬結(jié)平均直徑≥5 mm)，陽性率59.0%(62/105)；強(qiáng)陽性者19例(硬結(jié)平均直徑≥15 mm)，強(qiáng)陽性率18.1%(19/105)；ELISPOT陽性者15例，陽性率14.3%(15/105)；強(qiáng)陽性者3例，強(qiáng)陽性率2.9%(3/105)，詳見表1。

二、入伍新兵PPD試驗(yàn)和ELISPOT檢測結(jié)果比較

在62例PPD試驗(yàn)陽性者中，9例(14.5%)ELISPOT檢測陽性，53名ELISPOT檢測陰性；在43名PPD試驗(yàn)陰性者中，6例(14.0%)ELISPOT檢測陽性，37名ELISPOT檢測陰性；兩者的一致率為43.8%(46/105)，兩種方法檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.86，P=0.00)(表2)。

表1 2013年駐京部隊105名入伍新兵PPD試驗(yàn)及ELISPOT檢測結(jié)果

表2 2013年駐京部隊105名入伍新兵PPD試驗(yàn)和ELISPOT檢測結(jié)果比較

三、有卡痕入伍新兵的PPD試驗(yàn)結(jié)果

62例PPD試驗(yàn)陽性入伍新兵中，有卡痕者55例(88.7%)，PPD試驗(yàn)陰性者43例，有卡痕者18例(41.9%)。

四、入伍新兵BCG接種對兩種檢測方法的影響

給35例PPD試驗(yàn)和ELISPOT檢測均為陰性的入伍新兵接種BCG， 3個月后再次進(jìn)行PPD試驗(yàn)和ELISPOT檢測。結(jié)果13例PPD試驗(yàn)陽性，其中2例呈強(qiáng)陽性，陽轉(zhuǎn)率為37.1%；ELISPOT檢測仍然均為陰性。BCG接種前分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞SFCs為(2.6±3.1)個，接種后SFCs為(2.6±5.0)個，兩者間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，t=0.52，P=0.61。

討 論

目前LTBI的診斷缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”。國內(nèi)采用的PPD試驗(yàn)反應(yīng)的是機(jī)體對結(jié)核菌素純蛋白衍化物的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，其包含混合性抗原，因此與Mtb感染、BCG接種和非結(jié)核分枝桿菌感染均會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，存在假陽性結(jié)果，尤其是在結(jié)核病高流行并廣泛接種BCG的國家假陽性率更高。我國是結(jié)核病高流行國家，且約有76%的新生兒一出生就接種卡介苗[8]，因此PPD試驗(yàn)在我國篩查結(jié)核感染時，使用受到很大限制。而ELISPOT檢測技術(shù)是建立于T細(xì)胞免疫基礎(chǔ)上的γ干擾素釋放試驗(yàn)，可以克服PPD試驗(yàn)的部分缺點(diǎn)，其檢測LTBI的特異度高于PPD試驗(yàn)[9-10]。

2007年筆者首次應(yīng)用以重組CFP10-ESAT6融合蛋白為基礎(chǔ)的ELISPOT技術(shù)檢測了100例入伍新兵的LTBI情況[6]。2009年筆者應(yīng)用該方法共檢測1273例駐京部隊入伍新兵LTBI的情況[11-12]，本研究在既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對105例駐京部隊入伍新兵的LTBI現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查，并且進(jìn)一步了解BCG接種對該技術(shù)的影響，評價該技術(shù)在中國廣泛接種卡介苗的人群中的反應(yīng)情況。

2003—2006年駐京部隊入伍新兵的PPD試驗(yàn)陽性率為49.9%[13]，2007年為41.0%[6]；2009年P(guān)PD試驗(yàn)陽性率達(dá)到44.81%～50.2%[11-12]；而2013年入伍新兵的PPD試驗(yàn)陽性率為59.0%，高于以往水平，可能由于這批新兵卡介苗接種水平較高，PPD陽性者中88.7%接種了卡介苗。ELISPOT檢測陽性率僅為14.3%，進(jìn)一步說明PPD陽性人群中存在由于BCG接種及其他原因?qū)е碌募訇栃?。PPD試驗(yàn)和ELISPOT檢測結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法不具有相關(guān)性，這與以前研究結(jié)果一致[11-12，14]。本實(shí)驗(yàn)中PPD試驗(yàn)對動態(tài)的CFP10-ESAT6融合蛋白進(jìn)行ELISPOT檢測沒有影響，因?yàn)?5例PPD試驗(yàn)與ELISPOT檢測均陰性者接受BCG接種前后的ELISPOT檢測結(jié)果均為陰性。但前一次PPD試驗(yàn)對后一次PPD試驗(yàn)可能有影響，理論上2次檢測用了同一抗原，后一次反應(yīng)會受到前一次免疫的影響；本研究BCG接種3個月后PPD試驗(yàn)陽轉(zhuǎn)的受試者中，不能排除有些受試者對前一次PPD試驗(yàn)產(chǎn)生了免疫記憶反應(yīng)。

本研究對PPD試驗(yàn)及ELISPOT檢測陰性者接種BCG，3個月后復(fù)查PPD的陽轉(zhuǎn)率僅為37.1%，顯著低于李兵等[14]的研究報道，其對27名年齡18～20歲、PPD試驗(yàn)及ELISPOT檢測均為陰性的高校學(xué)生接種BCG，接種量為0.1 ml(含菌0.5 mg～0.75 mg)，3個月后發(fā)現(xiàn)PPD的陽轉(zhuǎn)率達(dá)到100%。在本研究中筆者使用了制劑推薦的接種量，即0.1 ml(僅含卡介菌0.05 mg)，未能誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的反應(yīng)，導(dǎo)致3個月后PPD陽轉(zhuǎn)率較低；隨著時間延長，PPD陽轉(zhuǎn)率將會逐漸提高；如筆者之前的研究顯示，BCG接種后7、10個月的陽轉(zhuǎn)率(77.3%、78.18%)明顯高于本研究[11-12]。目前我國兒童計劃免疫要求新生兒接種卡介苗，而我國鮮有報道在成年人中進(jìn)行BCG接種，因此，我國生產(chǎn)的卡介苗制劑都是適用于兒童的，經(jīng)過長期臨床應(yīng)用證明是安全、有效的，引發(fā)的不良反應(yīng)少。本研究按推薦劑量進(jìn)行成人接種，BCG接種量少，未能誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的反應(yīng)。由此可見，PPD的陽轉(zhuǎn)率與BCG接種劑量及接種后時間有關(guān)，接種劑量增多和時間延長，陽轉(zhuǎn)率會提高。此外，不同研究結(jié)果的差異也可能因?yàn)锽CG的生產(chǎn)廠家、批次不同或接種人員接種手法不同所致。

CFP10或ESAT6存在于結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌基因組的RD1區(qū)中，但在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌基因組中缺失。因此，應(yīng)用重組CFP10-ESAT6融合蛋白作為ELISPOT試驗(yàn)的刺激劑理論上不受卡介苗接種的影響。本研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，利用該融合蛋白對BCG接種前后人群的PBMC進(jìn)行體外刺激，誘導(dǎo)分泌IFN-γ的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)目在BCG接種前后基本相當(dāng)，并沒有受到BCG接種的影響，這一結(jié)果與筆者之前報告的卡介苗接種10個月后的結(jié)果一致[12]，可見重組CFP10-ESAT6融合蛋白作為ELISPOT試驗(yàn)的刺激劑在長期及短期時間內(nèi)都不受卡介苗接種的影響。

綜上所述，與PPD試驗(yàn)相比較，以重組CFP10-ESAT6融合蛋白作為刺激劑進(jìn)行ELISPOT檢測能更真實(shí)地反映駐京部隊入伍新兵的LTBI情況，而且不受卡介苗接種的影響。本方法的普及和推廣，對于部隊乃至全國的LTBI篩查及結(jié)核病的防控工作具有現(xiàn)實(shí)的意義。

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(本文編輯：王然 薛愛華)

The impact of BCG vaccination on tuberculosis infection detection with ELISPOT assay

BAI Xue-juan, LIANG Yan, YANG You-rong, WANG Lan, ZHANG Cui-ying, ZHANG Jun-xian, WU Xue-qiong.

Army Tuberculosis Prevention and Control Key Laboratory, Beijng Key Laboratory of New Techniques of Tuberculosis Diagnosis and Treatment, Institute for Tuberculosis Research, the 309th Hospital of Chinese PLA, Beijing 100091, China

WU Xue-qiong, Email: wu-xueqiong@263.net

Objective To study the impact of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) vaccine on enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay usingM.tuberculosisrecombinant CFP10-ESAT6 protein, and evaluate the application value of ELISPOT on diagnosis of latent tuberculosis infection (LTBI). Methods A total of 105 new recruits in Beijing in 2013 were intradermally injected with purified protein derivative (PPD)，and detected with ELISP0T assay using recombinant CFP10-ESAT6 fusion protein as a stimulus. New recruits with negative ELISPOT assay and negative PPD skin test were vaccinated by intradermal injection with BCG vaccine, and detected by PPD skin test and ELISPOT assay again 3 months later. The statistic analyses were performed using SPSS 18.0. The Chi-square test was used to assess the difference between rates, and theTtest was used to assess the difference between the average.Pvalue <0.05 was considered to be significantly different. Results Of 105 new recruits，the positive rates of PPD skin test and ELISPOT assay were 59.0% (62/105) and 14.3% (15/105), respectively．Of 43 PPD-negative and 62 PPD-positive new recruits, 6 (14.0%) and 9 (14.5%) were ELISPOT-positive, respectively.The results of these two methods had significant difference (χ2=35.86,P=0.00). Their agreement rate was 43.8% (46/105). Of 35 new recruits vaccinated by BCG vaccine 3 months later, 37.1% (13/35) were PPD-positive, but all of them were ELISPOT-negative. There was no statistical difference between the levels of IFN-γ before (2.6±3.1) and after (2.6±5.0) BCG vaccination (t=0.52,P=0.61). Conclusion BCG vaccination has no obvious impact on the ELISPOT assay, which is more feasible for the screening of LTBI in new recruits in Beijing.

Latent tuberculosis； BCG vaccine; Vaccination； Enzyme-linked immunospot assay; Recombinant fusion proteins

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.008

“十二五”全軍醫(yī)學(xué)科研重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J050)；“十二五”國家重大科技專項(xiàng)(2013ZX10003003-005)

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

吳雪瓊，Email: wu-xueqiong@263.net

2015-02-10)