李晉 楊倩婷 岳建榮 林玲 張明霞 顧美紅 鄧群益 鄧國防 鄧永聰 陳心春

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·論著·

γ干擾素釋放試驗與結(jié)核菌素皮膚試驗在肺結(jié)核患者密切接觸者隨訪中的應(yīng)用比較

李晉 楊倩婷 岳建榮 林玲 張明霞 顧美紅 鄧群益 鄧國防 鄧永聰 陳心春

目的 比較γ干擾素釋放試驗(IGRAs)和結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)在篩查肺結(jié)核密切接觸者是否發(fā)生結(jié)核感染中的效能。方法 對138名肺結(jié)核患者的密切接觸者[分別為家屬(60名)和同事(78名)]每6個月進行酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)和TST平行檢測，同時了解結(jié)核病的發(fā)生情況，共隨訪24個月；統(tǒng)計分析ELISPOT和TST檢測結(jié)果與疾病發(fā)生和結(jié)核分枝桿菌暴露的關(guān)系。結(jié)果 在2年的隨訪中，累計發(fā)現(xiàn)11例新發(fā)活動性肺結(jié)核。與127名完成2年共5次隨訪的未發(fā)病密切接觸者相比，新發(fā)活動性肺結(jié)核發(fā)病人群第一次ELISPOT檢測的陽性率為72.7%(8/11)，顯著高于未發(fā)病人群的陽性率33.1%(42/127)，χ2=6.8905，P=0.0087；而TST檢測的陽性率分別是63.6%(7/11)、66.9%(85/127),χ2=0.0494，P=0.8241，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ELISPOT陽性率與結(jié)核分枝桿菌暴露程度有關(guān)，暴露程度較高的密切接觸者(家屬)的陽性率為45.0%(27/60)，顯著高于暴露程度較低的同事[28.2%(22/78)]，χ2=4.1773，P=0.0410；而TST檢測的陽性率分別為55.0%(33/60)和75.6%(59/78)，與結(jié)核分枝桿菌暴露程度不一致。 結(jié)論 ELISPOT篩查肺結(jié)核密切接觸者中高危人群的特異度顯著高于TST，能更準確地反映結(jié)核分枝桿菌暴露后的感染情況。

結(jié)核,肺/診斷； 接觸者追蹤； 干擾素γ釋放試驗； 結(jié)核菌素試驗； 酶聯(lián)免疫斑點測定； 隨訪研究

篩查肺結(jié)核密切接觸者是否發(fā)生結(jié)核感染，并對潛伏結(jié)核感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)進行預(yù)防性化療，是根除結(jié)核病的一個重要措施，也是當前一些結(jié)核病低流行的發(fā)達國家采用的結(jié)核病防控策略。我國是結(jié)核病高負擔國家，早期發(fā)現(xiàn)和治療活動性肺結(jié)核患者以減少社區(qū)的傳播顯得十分重要。而由于潛伏感染人群巨大，以及患者對預(yù)防性化療的依從性差，至少短期內(nèi)很難實施LTBI的干預(yù)化療。在潛伏感染人群中，約10%進展為活動性結(jié)核病，這些新發(fā)結(jié)核病患者進而造成新的傳播，從而影響結(jié)核病的控制效果。因此，如何從LTBI中篩選出可能進展為活動性結(jié)核病的個體進行預(yù)防性化療，對于實現(xiàn)結(jié)核病徹底控制的目標具有重要意義。

結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)和γ干擾素釋放試驗(IGRAs)是當前用于LTBI診斷的兩種主要技術(shù)。由于結(jié)核病的流行情況等多種因素影響，不同地區(qū)對于兩種方法在LTBI診斷的應(yīng)用方面存在不同的意見，在具體的應(yīng)用中兩種技術(shù)可能各有優(yōu)勢。 另一方面，肺結(jié)核患者密切接觸者是結(jié)核分枝桿菌感染和發(fā)生結(jié)核病的高危人群。為此，筆者通過對密切接觸者的定期隨訪，比較IGRAs和TST對結(jié)核病密切接觸者人群中篩查LTBI的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究對象

2010—2014年間來我院就診的活動性肺結(jié)核患者的密切接觸者，在肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)的2周以內(nèi)，每6個月隨訪檢測1次結(jié)核感染和發(fā)病情況，包括酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測、TST檢測、胸片，以及臨床癥狀等[1]。 本研究僅對完成5次隨訪的138名受試者進行統(tǒng)計分析。其中密切接觸者納入標準:(1)自愿參加隨訪，簽署知情同意書；(2)在活動性肺結(jié)核患者治療之前與其一起居住、密切接觸6個月以上(家庭成員、同一辦公室同事)；(3)入組時年齡>14周歲；(4)排除機體免疫缺陷疾病(先天性免疫缺陷、HIV感染)、重度營養(yǎng)不良及免疫抑制劑使用者。本研究獲得深圳市第三人民醫(yī)院倫理委員會的審查和批復(fù)。

二、主要試劑

1.TST 檢測標準PPD：購于四川成都生物制品研究所。

2.ELISPOT 檢測的主要試劑: 包被抗體(anti-human IFN-γ)、檢測抗體(affinity purified anti-human IFN-γ) 及 酶 聯(lián) 二 抗 (streptavidin，alkalin phosphatase conjugated anti-IgG)，前兩者購自 eBioscience公司(美國)，后者購自 Pierce公司(美國)；堿性磷酸酶底物顯色試劑盒[對甲苯胺藍(BCIP)+四唑硝基藍(NBT),BCIP+NBT]購自Thermo(美國)；而 ELISPOT 檢測中所使用的結(jié)核菌重組蛋白早期分泌抗原靶6(ESAT-6)為深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所自行制備[2-3]；重組培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)-ESAT-6融合蛋白(重組CFP-10-ESAT-6融合蛋白，簡稱“多肽抗原”)由深圳瀚宇生物技術(shù)公司合成，純度超過 95%。ELISPOT讀數(shù)系統(tǒng)(Bioreader 4000 Pro-X) 為德國BioSys公司產(chǎn)品。

3.痰涂片主要材料:痰涂片所需黏附載片(超白玻璃，高清潔度，規(guī)格：25 mm×75 mm，厚度：1～1.2 mm)，購于江蘇省世泰實驗器材有限公司。

三、方法及步驟

1.一般要求：所有的密切接觸受訪者均要求進行胸部X線檢查、ELISPOT及TST檢測。胸部X線檢查有異常者，結(jié)合其臨床癥狀、病史開展相應(yīng)的相關(guān)輔助檢查、綜合檢查，以及臨床治療情況由傳染病?？漆t(yī)生排除其他疾病的可能性；參照2001年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》標準，確定肺結(jié)核診斷。

2.ELISPOT 檢測：采集密切接觸者外周全血5 ml(肝素鋰抗凝)，分離外周血單個核細胞(PBMCs)，在預(yù)先包被好的抗體的平板中加入細胞100 μl/孔，每孔細胞濃度為2×105個細胞。陰性對照孔中不加任何刺激物；陽性對照每孔加入自然凝集素(PHA)5 μg,終濃度5 μg/ml；實驗孔加入本實驗室自行制備的抗原ESAT-6及多肽抗原，終濃度為每孔5 μg/ml。繼而移至 5% CO2培養(yǎng)箱 37 ℃培養(yǎng) 16～24 h。第二天洗板后，先加入檢測抗體于CO2培養(yǎng)箱孵育 1 h，然后洗板，再加入親和素繼續(xù)CO2培養(yǎng)箱孵育 1 h，繼而洗板，最后加入顯色劑顯色。待顯色洗板后，采用酶聯(lián)斑點圖像分析儀讀數(shù)，記錄斑點數(shù)量。按照 ELISPOT 試劑說明書及根據(jù)前期ROC曲線，以ESAT-6蛋白抗原孔中形成的斑點形成細胞(SFCs)≥40個，或多肽抗原孔中SFCs≥30 個判斷為陽性[4]。

3.TST檢測方法：采血后由深圳市第三人民醫(yī)院結(jié)核病區(qū)有經(jīng)驗的醫(yī)院工作人員在密切接觸者左側(cè)前臂內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射由四川生物制品公司生產(chǎn)的標準PPD 0.1 ml(含 BCG PPD 5 IU)，使局部形成皮丘。48～72 h 后，記錄硬結(jié)平均直徑。按硬結(jié)平均直徑≥15 mm為陽性[5]。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

對于配對樣本進行ELISPOT及TST檢測結(jié)果的統(tǒng)計，采用配對四格表統(tǒng)計分析；對于兩組間的差別，采用非配對t檢驗；對于等級資料，采用行列表進行統(tǒng)計分析，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、138名結(jié)核病密切接觸者的隨訪情況

在隨訪周期內(nèi)，累計發(fā)現(xiàn)11例新發(fā)活動性結(jié)核病患者，其中男∶女=1.75∶1 (7/4)，平均年齡(27.64±17.76)歲。 完成2年5次隨訪未發(fā)病的密切接觸者127名，其中男∶女=1.44∶1 (75/52)，平均年齡(28.34±13.66)歲。新發(fā)活動性肺結(jié)核ELISPOT、TST及結(jié)核分枝桿菌暴露程度(與傳染源的關(guān)系),詳見表1。

二、未發(fā)病人群和新發(fā)病人群中ELISPOT及TST檢測的結(jié)果比較

比較隨訪2年間未發(fā)病和發(fā)病的兩組人群第一次(隨訪的第1個月)ELISPOT 和TST檢測結(jié)果，ELISPOT檢測陽性率分別為33.1%和72.7%，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0087)；而TST 檢測陽性率分別為66.9%和63.6%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.8241)(表2)。

三、ELISPOT與TST檢測結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌暴露程度的關(guān)系

結(jié)核感染和結(jié)核病的發(fā)生與結(jié)核分枝桿菌暴露程度密切相關(guān)[2,6]，為了探討ELISPOT與TST檢測結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌暴露程度的關(guān)系，筆者比較了暴露程度顯著差別的家屬和同事ELISPOT與TST檢測的陽性率(表3)。雖然本研究未能精確計算家屬和同事的具體暴露時間，但已有資料表明家屬的結(jié)核分枝桿菌暴露程度顯著高于同事。與此一致，筆者發(fā)現(xiàn)11例新發(fā)患者中8例為家屬，而只有3例是同事，盡管完成2年隨訪的人群中家屬人數(shù)(60名)少于同事(78名)。值得注意的是：雖然TST和ELISPOT檢測陽性率在家屬和同事中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但兩者檢測結(jié)果的方向截然相反(表3)，暴露程度較高的家屬TST檢測陽性率反而低于暴露程度較低的同事。

表1 新發(fā)活動性肺結(jié)核患者情況一覽表

注 根據(jù)第7版《傳染病學(xué)》表中胸片診斷Ⅲ型肺結(jié)核即為繼發(fā)性肺結(jié)核，分子代表左肺，分母代表右肺，上、中、下代表左右肺的結(jié)核發(fā)生位置，(-/+)代表影像學(xué)的陰/陽性

表2 結(jié)核病接觸者第一次隨訪ELISPOT及TST檢測結(jié)果比較

注 表中括號內(nèi)數(shù)值分子為陽性例數(shù)，分母為檢測人數(shù)(名)

表3 隨訪2年時(第五次隨訪)ELISPOT與TST檢測結(jié)果在不同結(jié)核分枝桿菌暴露人群中的比較

注 表中括號內(nèi)數(shù)值分子為陽性例數(shù)，分母為檢測人數(shù)(名)

表4 密切接觸者ELISPOT及TST檢測結(jié)果與傳染源痰A(chǔ)FB分級的關(guān)系

注 表中括號內(nèi)數(shù)值分子為陽性例數(shù)，分母為檢測人數(shù)(名)

除暴露時間和密切接觸程度外，研究報道傳染源痰結(jié)核分枝桿菌檢測情況也是決定密切接觸者暴露程度的重要因素[7]。為此，筆者進一步分析了密切接觸者的傳染源。痰涂片抗酸桿菌(AFB)分級的結(jié)果與ELISPOT和TST檢測結(jié)果的關(guān)系(表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傳染源的AFB分級結(jié)果與密切接觸者ELISPOT和TST檢測的結(jié)果沒有相關(guān)性。

討 論

IGRAs和TST是當前用于LTBI診斷的兩個主要手段，由于LTBI診斷缺乏金標準，有關(guān)兩者在LTBI診斷中的優(yōu)缺點一直存在爭議，直至最近WHO和多個國家與地區(qū)根據(jù)做出了相應(yīng)的應(yīng)用指南[8-10]。但另一方面，由于LTBI者本身異質(zhì)性明顯， 包括了從穩(wěn)定的LTBI到即將要發(fā)病的LTBI，因此，從LTBI中進一步篩查結(jié)核病發(fā)生高風(fēng)險(即將要發(fā)病的LTBI)要遠比籠統(tǒng)的診斷LTBI重要，也是當前結(jié)核病診斷最為嚴峻的挑戰(zhàn)之一。本研究采用自制IGRAs試劑，通過對完成了2年5次隨訪的127名未發(fā)病的密切接觸者與隨訪期間發(fā)現(xiàn)的11例新發(fā)活動性結(jié)核病患者進行IGRAs和TST平行檢測分析，發(fā)現(xiàn)IGRAs較TST在密切接觸者人群的隨訪中更有優(yōu)勢。理由是，11例新發(fā)患者與未發(fā)病的接觸者比較，前者IGRAs陽性率顯著增高，而TST陽性率則差異無統(tǒng)計學(xué)意義；再有，IGRAs檢測陽性率與結(jié)核分枝桿菌暴露程度呈正相關(guān)，而TST檢測結(jié)果與暴露無關(guān)，其結(jié)果與暴露程度相反。雖然，筆者尚不明確本項目中結(jié)核分枝桿菌暴露程度較高的密切接觸者(家屬)的TST檢測陽性率反而低于接觸程度較低的密切接觸者(同事)的確切原因，但至少說明在密切接觸者中篩選LTBI時，TST的檢測效率有限。筆者此前的研究表明,TST檢測陰性的成年人在BCG接種3個月后，TST檢測結(jié)果96%(26/27)轉(zhuǎn)為陽性，而ELISPOT檢測的陽性率不受影響[3]。因此，上述TST檢測結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌暴露程度不一致，可能是由于TST不能有效區(qū)分BCG接種和LTBI所造成的。另外，由于TST檢測無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和非結(jié)核分枝桿菌感染[11]， 本項目入組人群年齡>14歲，環(huán)境中反復(fù)暴露的非結(jié)核分枝桿菌所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可能是TST檢測結(jié)果與暴露程度不一致，甚至相反的另一種可能原因。

盡管上述結(jié)果表明IGRAs較TST檢測在密切接觸者中篩查LTBI更有優(yōu)勢，但僅僅通過IGRAs檢測，在11例新發(fā)活動性肺結(jié)核患者中ELISPOT檢測陽性率只有72.7%。相反，雖然TST檢測陽性率為63.6%；但聯(lián)合ELISPOT檢測的陽性率將達到90.9%，表明IGRAs聯(lián)用TST有利于提高對密切接觸者中高風(fēng)險人群篩查診斷的敏感度，可以發(fā)現(xiàn)絕大部分(10/11)密切接觸者中的LTBI患者。對1例IGRAs和TST檢測均陰性的患者的臨床資料進行核查，確認肺結(jié)核的診斷。該患者年齡為73歲，無合并其他疾病，外周血T淋巴細胞計數(shù)正常；因此，考慮是年齡大、免疫抑制導(dǎo)致的ELISPOT和TST檢測結(jié)果陰性，但確切的原因尚需要進一步研究確定。另外，在隨訪中筆者發(fā)現(xiàn)11例新發(fā)活動性肺結(jié)核有5例在隨訪6個月發(fā)病，5例在隨訪1年時發(fā)病，1例在隨訪2年時發(fā)病，提示我們隨訪篩查高危人群，大部分活動性結(jié)核病患者的密切接觸者發(fā)病時間發(fā)生在18個月內(nèi)，這提示在日后對結(jié)核病患者的密切接觸者隨訪時間至少要延長到18個月以上。

動物實驗中，暴露的細菌濃度越高，感染的機會越多。流行病學(xué)結(jié)果是暴露于結(jié)核分枝桿菌載量越高的傳染源的密切接觸者，其發(fā)生感染的風(fēng)險越高[6]。然而本研究的結(jié)果說明，無論是密切接觸者的IGRAs還是TST檢測陽性率均與傳染源的AFB的等級沒有相關(guān)性。這一結(jié)果提示，肺結(jié)核傳染性的高低不能依靠痰涂片結(jié)果來確定，涂片陰性者仍然有傳染性。但有必要指出，筆者選擇138例完成了2年隨訪的密切接觸者進行分析，不能代表所有的密切接觸者的情況。另外，痰涂片AFB分級是一個粗略的定量手段，不夠精確；也不能排除IGRAs和(或)TST檢測敏感度有局限性的問題。

最后，有必要指出的是，本研究隨訪發(fā)現(xiàn)的11例新發(fā)肺結(jié)核患者中，有27.3% 為IGRAs檢測陰性，有36.4% 為TST檢測陰性。這一結(jié)果表明，無論是ELISPOT還是TST檢測，其在密切接觸者中篩查發(fā)現(xiàn)新發(fā)患者的敏感度均不足。因此，在臨床實踐中，尤其是在新的有效篩查檢測方法面世之前，應(yīng)該在做IGRAs檢測的同時聯(lián)合常規(guī)癥狀和胸部影像學(xué)檢查結(jié)果加以綜合考慮，以期提高早期發(fā)現(xiàn)的敏感度和準確率。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會. 肺結(jié)核診斷和治療指南. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2001,24(2):70-74.

[2] Chen X, Yang Q, Zhang M, et al. Diagnosis of active tuberculosis in China using an in-house gamma interferon enzyme-linked immunospot assay. Clin Vaccine Immunol,2009,16(6):879-884.

[3] Zhang M, Wang H, Liao M, et al. Diagnosis of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guérin vaccinated subjects in China by interferon-gamma ELISpot assay. Int J Tuberc Lung Dis,2010,14(12):1556-1563.

[4] 陳心春，廖明鳳，朱秀云，等. 結(jié)核菌特異性IFN-γ Elispot檢測在活動性結(jié)核病和結(jié)核感染診斷中的應(yīng)用. 中國防癆雜志,2010,32(11):747-751.

[5] 戰(zhàn)云飛，劉風(fēng)霞，楊效光，等. 結(jié)核診斷指標在診斷肺結(jié)核中的臨床意義. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2013,23(21):5369-5371.

[6] Muzzi A, Seminari E, Feletti T, et al. Post-exposure rate of tuberculosis infection among health care workers measured with tuberculin skin test conversion after unprotected exposure to patients with pulmonary tuberculosis: 6-year experience in an Italian teaching hospital. BMC Infect Dis,2014,14:324.

[7] Tornee S, Kaewkungwal J, Fungladda W, et al. Risk factors for tuberculosis infection among household contacts in Bangkok, Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health,2004,35(2):375-383.

[8] Horsburgh CR Jr. Priorities for the treatment of latent tuberculosis infection in the United States. N Engl J Med, 2004, 350(20):2060-2067.

[9] Mazurek GH, Jereb J, Vernon A, et al. Updated guidelines for using Interferon Gamma Release Assays to detectMycobacteriumtuberculosisinfection-United States, 2010. MMWR Recomm Rep,2010,59(RR-5):1-25.

[10] Denkinger CM, Dheda K, Pai M. Guidelines on interferon-γ release assays for tuberculosis infection: concordance, discor-dance or confusion? Clin Microbiol Infect, 2011, 17(6):806-814.

[11] 林玲，劉厚明，鄧群益，等. γ干擾素釋放試驗在肺結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌肺病鑒別診斷中的應(yīng)用價值. 中國防癆雜志,2014,36(6):477-481.

(本文編輯：薛愛華)

Evaluation of interferon-gamma release assays and tuberculin skin test in screening active tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of pulmonary tuberculosis patients

LI Jin, YANG Qian-ting, YUE Jian-rong, LIN Ling, ZHANG Ming-xia, GU Mei-hong, DENG Qun-yi, DENG Guo-fang, DENG Yong-cong, CHEN Xin-chun.

Shenzhen Key Laboratory of Infection and Immunity, Guangdong Key Laboratory of Diagnosis and Treatment of Emerging Infectious Diseases, Guangdong Medical College, Shenzhen Third People’s Hospital, Shenzhen 518020,China

CHEN Xin-chun, Email: chenxinchun@hotmail.com

Objective To evaluate the efficiency of interferon release assays (IGRAs) and tuberculin skin test (TST) in screening active tuberculosis (TB) and latent tuberculosis infection (LTBI) in close contacts of pulmonary TB patients. Methods Samples of 138 close contacts of TB patients from family members (60 cases) and colleagues (78 cases) were collected. ELISPOT test (ELISPOT) and TST parallel detection were done every six months during the whole process of 24 months. Statistical analysis of the relationship between the results and disease occurrence andMycobacteriumtuberculosisexposure was performed. Results Among 138 close contacts who completed 5 times of follow-up detection in a period of 24-month, 11 cases developed to active PTB. Of the 11 patients, the positive rate of first ELISPOT was 72.7% (8/11), which was significantly higher than that of the unaffected (33.1%, 42/127)(χ2=6.8905,P=0.0087).While the positive rates of first TST were 63.6% (TB) and 66.9% (unaffected) respectively, and the difference was not statistically significant (χ2=0.0494,P=0.8241). ELISPOT positive rate was correlated to the degree of exposure toMycobacteriumtuberculosis.In high level exposure close contacts (families), ELISPOT positive rate was 45.0% (27/60), which was significantly higher than the low level exposure colleagues (28.2%, 22/78)(χ2=4.1773,P=0.0410). While TST positive rates among the high and low level exposure group were 55.0% (33/60) and 75.6% (59/78) respectively, which was inconsistent withMycobacteriumtuberculosisexposure level. Conclusion Compared to TST, IGRAs-ELISPOT has higher specificity in high risk population in close contacts of PTB cases, and is more accurate in the detection of active TB and LTBI in close contact of PTB patients.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Contact tracing； Interferon-gamma release tests； Tuberculin test; Enzyme-linked immunospot assay； Follow-up studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.007

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003004-002-006)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2014354)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20130329171031741)

5180202 廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市第三人民醫(yī)院深圳市感染免疫重點實驗室 廣東省新發(fā)傳染病診治重點實驗室(李晉、楊倩婷、林玲、張明霞、顧美紅、陳心春)，內(nèi)科(岳建榮、鄧群益、鄧國防、鄧永聰)

陳心春，Email：chenxinchun@hotmail.com

2015-02-11)