梁艷 王蘭 張翠英 王志耘 侯英 陽幼榮 張俊仙 趙文娟 吳雪瓊

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·論著·

兩種γ干擾素釋放試驗及PPD試驗結(jié)果在結(jié)核感染診斷中的比較

梁艷 王蘭 張翠英 王志耘 侯英 陽幼榮 張俊仙 趙文娟 吳雪瓊

目的 研究2種γ干擾素(IFN-γ)釋放試驗(interferon-γ release assays，IGRA)和 PPD 試驗在結(jié)核感染診斷中的相關(guān)性及應(yīng)用價值。方法 對2010年178名駐京部隊河南籍入伍新兵進(jìn)行PPD試驗，用結(jié)核分枝桿菌特異性重組培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)-早期分泌性靶抗原6(early secretory antigenic target 6，ESAT6)融合蛋白(重組CFP10-ESAT6 融合蛋白)-酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme linked-immunospot assay，ELISPOT)檢測新兵外周血釋放 IFN-γ的效應(yīng) T淋巴細(xì)胞，并用結(jié)核分枝桿菌 CFP10-ESAT6 重組蛋白-化學(xué)發(fā)光酶免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)檢測其全血中 IFN-γ 水平。結(jié)果 178 名入伍新兵中，PPD試驗、ELISPOT和CLEIA的陽性率分別為 39.89%(71/178)、31.46%(56/178) 和 21.35%(38/178)。前者陽性率顯著高于后二者(χ2=14.3663，P<0.01)，ELISPOT法陽性率也顯著高于CLEIA法(χ2=4.6834，P<0.05)。在107名PPD試驗陰性者中， ELISPOT、CLEIA法檢測陽性者分別為33例(30.84%)、14例(13.08%)，前者陽性率顯著高于后者(χ2=9.8425，P<0.01)。在71例PPD陽性者中，ELISPOT、CLEIA法檢測陽性者分別為23例(32.39%)、24 例(33.80%)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.0318，P>0.05)。ELISPOT法和PPD試驗的一致率為 54.49%(97/178，U=0.218，P>0.05)；CLEIA法和PPD試驗的一致率為 65.73% (117/178，U=3.227，P<0.01)，ELISPOT和CLEIA法的一致率為66.29%(118/178，U=1.885，P>0.05)；PPD試驗、ELISPOT和CLEIA檢測方法的一致率為 42.70%(76/178)。ELISPOT法檢測的斑點數(shù)與PPD試驗反應(yīng)的硬結(jié)平均直徑之間缺乏相關(guān)性(r=0.138 51，P>0.05)；CLEIA 法檢測的IFN-γ水平與PPD試驗反應(yīng)的硬結(jié)平均直徑之間有低的相關(guān)性(r=0.252 44，P<0.01)；ELISPOT檢測的斑點數(shù)與CLEIA檢測的IFN-γ水平之間也有低的相關(guān)性(r=0.2755，P<0.01)。在卡介苗接種者中，PPD試驗檢測的陽性率為50.00% (48/96)，ELISPOT為22.92% (22/96)，CLEIA為23.96%(23/96)；在無卡介苗接種者中，PPD試驗檢測的陽性率為28.05% (23/82)，ELISPOT為47.56%(39/82)，CLEIA為17.07%(14/82)。結(jié)論 兩種IGRA方法與PPD試驗之間的一致性差、相關(guān)性低，用IGRA方法能夠有效地篩查結(jié)核感染，而ELISPOT檢測的陽性率高于CLEIA。

潛伏性結(jié)核/診斷; 干擾素γ釋放試驗； 結(jié)核菌素試驗; 酶聯(lián)免疫斑點測定； 免疫酶技術(shù)

結(jié)核病是慢性呼吸道傳染病，目前我國約有5.5億人感染了結(jié)核分枝桿菌[1]。結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗是結(jié)核病輔助診斷的一種重要方法，但由于純蛋白衍生物是多種抗原的混合物，所含抗原為致病性結(jié)核分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗(BCG)菌株所共有，其結(jié)果受到BCG接種及其他環(huán)境分枝桿菌感染的影響，診斷特異度低；由于我國約76%的新生兒接種了BCG[1]，而PPD試驗不能區(qū)分是結(jié)核感染還是BCG接種[2-3]。因此，目前結(jié)核潛伏感染的診斷缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”。筆者以結(jié)核分枝桿菌特異性重組培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)-早期分泌性靶抗原6(early secretory antigenic target 6，ESAT6)融合蛋白(重組CFP10-ESAT6融合蛋白)為刺激劑，建立了2種新的、結(jié)核特異的γ干擾素(IFN-γ)釋放試驗(interferon-γ release assays，IGRA)：一種是酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme linked-immunospot assay，ELISPOT)，該方法能夠檢測外周血單個核細(xì)胞中分泌結(jié)核特異的IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的斑點數(shù)[4-6]；另一種是全血IFN-γ釋放試驗，用化學(xué)發(fā)光酶免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)檢測血漿中分泌的結(jié)核特異的IFN-γ水平。部隊軍事人員集中居住、訓(xùn)練，生活、工作中接觸密切，入伍新兵來自全國各地，結(jié)核感染情況不同；因此，軍事人員是結(jié)核感染的高危人群[7]。筆者研究PPD試驗、ELISPOT和CLEIA 3種檢測方法在診斷結(jié)核感染時的相關(guān)性及應(yīng)用價值，為駐京部隊入伍新兵中結(jié)核潛伏感染者篩查方法的選擇提供實驗依據(jù)，為發(fā)現(xiàn)高危人群，以及制定軍隊結(jié)核病預(yù)防、控制策略奠定基礎(chǔ)。

對象和方法

一、研究對象

178名2010年駐京部隊河南籍入伍新兵，均為男性，年齡17～24歲，平均年齡(19.2±1.7)歲，常規(guī)胸部X線檢查均為陰性。本研究經(jīng)解放軍第三〇九醫(yī)院倫理委員會審核并通過，同時征得受試對象同意。

二、研究方法

1. 標(biāo)本采集：采集駐京部隊河南籍入伍新兵靜脈血2管，每管4 ml，均用肝素鈉抗凝，一管用于ELISPOT檢測，一管用于全血IFN-γ釋放試驗。

2. PPD試驗：采集靜脈血后，進(jìn)行PPD試驗。具體方法如下：吸取卡介菌PPD (50 IU/ml) 0.1 ml(5 IU)，采用Mantoux法注射于前臂掌側(cè)皮內(nèi)。于注射后72 h檢查注射部位反應(yīng)，若硬結(jié)平均直徑≥5 mm為陽性，5～9 mm為一般陽性(+)，10～19 mm為中度陽性(++)，≥20 mm為強(qiáng)陽性(+++)(硬結(jié)平均直徑<20 mm，局部發(fā)生水皰或壞死也為強(qiáng)陽性)[8]。參加研究人員為經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的全軍結(jié)核病防治隊人員，負(fù)責(zé)查驗雙上臂有否BCG接種瘢痕；PPD試驗后檢查、測量PPD反應(yīng)情況及硬結(jié)平均直徑。

3．ELISPOT方法：采用上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司的結(jié)核感染T細(xì)胞檢測試劑盒(F-SPOT.TB)，按說明書操作。簡述如下：(1)外周血單個核細(xì)胞分離及計數(shù)：取4～5 ml外周血(抗凝)，用淋巴細(xì)胞分層液分離、提取單個核細(xì)胞(PBMCs)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106/L。(2)分泌IFN-γ的T細(xì)胞檢測：每個測試樣本需要微孔板3孔：在陰性對照孔內(nèi)加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液50 μl；在陽性對照孔內(nèi)加入陽性對照植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)50 μl；在2個測試孔內(nèi)分別加入重組CFP10-ESAT6融合蛋白50 μl。分別在上述各孔內(nèi)，加100 μl含有2×105個PBMCs的懸液，將微孔板置于37 ℃、含5% CO2的孵箱中孵育20 h；棄培養(yǎng)上清，加入200 μl于4 ℃下預(yù)冷的無菌蒸餾水裂解細(xì)胞10 min，用200 μl 1×PBST[磷酸鹽緩沖液(PBS)-Tween20(PBST)]洗板3次，1 min/次，最后1次洗板后拍干；在每個孔中加入100 μl用PBS稀釋的生物素標(biāo)記抗體(1∶200稀釋)，于37 ℃下孵育1 h；洗板后，加入100 μl用PBS稀釋的鏈親合素-堿性磷酸酶(1∶200稀釋)，于37 ℃下孵育30 min；洗板后，每孔加入顯色液100 μl，于37 ℃下閉光顯色7～15 min；可見板底顯示紫藍(lán)色斑點，在96孔聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜板中加入雙蒸水或去離子水終止反應(yīng)，將板放入37 ℃烘箱中干燥30 min。使用酶聯(lián)斑點分析儀或放大鏡計數(shù)著色的斑點，每一個點代表一個分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞。當(dāng)陽性對照孔斑點數(shù)≥20個，陰性對照孔斑點數(shù)<13個，檢測孔斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)≥16個，可判斷所檢測標(biāo)本為陽性；陽性對照孔斑點數(shù)≥20個，當(dāng)陰性對照孔斑點數(shù)≥13個、≤20個，檢測孔斑點數(shù)為陰性對照孔斑點數(shù)的2倍，可判斷所檢測標(biāo)本為陽性。

4. 全血IFN-γ釋放試驗(CLEIA)：直接將肝素抗凝的全血與陽性對照PHA、CFP10-ESAT6融合蛋白，以及陰性對照完全細(xì)胞培養(yǎng)液共同孵育18～20 h；如果受試者感染過結(jié)核分枝桿菌，其外周血會有特異效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，在體外再次受到抗原刺激時會釋放分泌IFN-γ并彌散至血漿中；用CLEIA的方法檢測血漿中IFN-γ的水平來達(dá)到診斷的目的。根據(jù)前期研究，檢測孔IFN-γ的水平減去陰性對照孔IFN-γ的水平≥396.5 pg/ml，可判斷所檢測標(biāo)本為陽性[9]。

5. 統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SAS 6.12軟件處理數(shù)據(jù)，定性資料的差異性分析用R×C表假設(shè)檢驗，兩組定性資料的一致性檢驗用Kappa檢驗；正態(tài)分布的定量資料的差異性分析用單因因素方差分析，兩兩比較用Dunnettt檢驗，偏態(tài)分布的定量資料用秩和(Kruskal-Wallis)檢驗，兩兩比較用q檢驗；兩組定量資料的相關(guān)分析用Pearson線性相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、入伍新兵PPD試驗、ELISPOT和CLEIA檢測結(jié)果

178名駐京部隊河南籍入伍新兵的PPD試驗、ELISPOT和CLEIA檢測結(jié)果見表1。其中PPD試驗陽性者71例(39.89%，71/178)、強(qiáng)陽性者4例(2.25%)，ELISPOT陽性者56例(31.46%)，CLEIA陽性者38例(21.35%)，PPD試驗陽性率顯著高于2種IGRA試驗(χ2=14.3663，P=0.0008)，ELISPOT陽性率也顯著高于CLEIA法(χ2=4.6834，P<0.05)。在107名PPD陰性者中，33例(30.84%，33/107)為ELISPOT陽性，14例(13.08%，14/107)為CLEIA陽性，ELISPOT陽性率顯著高于CLEIA陽性率(χ2=9.8425，P<0.01)；在71例PPD陽性者中，23例(32.39%，23/71)為ELISPOT陽性，24例(33.80%，24/71)為CLEIA陽性，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.0318，P>0.05)。

表1 2010年178名河南籍入伍新兵PPD試驗、ELISPOT和 CLEIA檢測結(jié)果

注a：與CLEIA法比較，χ2=9.8425，P<0.01；b：與CLEIA法比較，χ2=4.6834，P<0.05；c：與PPD試驗陰性組比較，χ2=11.2931，P<0.01

二、入伍新兵PPD試驗、ELISPOT和CLEIA檢測結(jié)果的兩兩比較

71例PPD試驗陽性者，ELISPOT檢測陽性23例(32.39%)、陰性48名；107名PPD試驗陰性者，ELISPOT檢測陽性33例(30.84%)、陰性74例；兩者的一致率為54.49%(97/178)，兩種檢測結(jié)果一致性分析顯示，ELISPOT與PPD試驗之間缺乏一致性(U=0.218，P>0.05；Kappa=0.0161)，結(jié)果見表2。兩種檢測結(jié)果相關(guān)性分析顯示ELISPOT斑點數(shù)與PPD試驗硬結(jié)平均直徑之間缺乏相關(guān)性(r=0.138 51，P>0.05)，其散點圖見圖1。

表2 2010年178名河南籍入伍新兵PPD試驗和ELISPOT檢測結(jié)果比較(例或名)

圖1 2010年178名河南籍入伍新兵ELISPOT法和PPD試驗檢測結(jié)果的關(guān)系

71例PPD試驗陽性者，CLEIA檢測陽性與陰性者分別為24例(33.80%)、47名(66.20%)；107名PPD試驗陰性者，CLEIA檢測陽性與陰性者分別為14例(13.08%)、93名(86.92%)，兩者的一致率為65.73%(117/178)。兩種檢測結(jié)果一致性分析顯示，CLEIA與PPD試驗之間的一致性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(U=3.227，P<0.01；Kappa=0.2248)，結(jié)果見表3。兩種檢測結(jié)果相關(guān)性分析顯示，CLEIA檢測的IFN-γ水平與PPD試驗硬結(jié)平均直徑之間有相關(guān)性(r=0.252 44，P<0.01)，其散點圖見圖2。

表3 2010年178名河南籍入伍新兵PPD試驗和CLEIA法檢測結(jié)果比較(例或名)

圖2 2010年178名河南籍入伍新兵CLEIA法和PPD試驗檢測結(jié)果的關(guān)系

56例ELISPOT檢測陽性者，CLEIA檢測17例(30.36%)為陽性、39名為陰性；在122名ELISPOT陰性者中，CLEIA檢測21例(17.21%)為陽性，101名為陰性；兩者的一致率為66.29%(118/178)。兩種檢測結(jié)果一致性分析顯示，ELISPOT與CLEIA、PPD試驗之間缺乏一致性(U=1.885，P>0.05；Kappa=0.1440)，結(jié)果見表4。兩種檢測結(jié)果相關(guān)性分析顯示ELISPOT斑點數(shù)與CLEIA檢測的IFN-γ水平相關(guān)(r=0.2755，P<0.01)，其散點圖見圖3。

表4 2010年178名河南籍入伍新兵ELISPOT和 CLEIA檢測結(jié)果比較 (例或名)

圖3 2010年178名河南籍入伍新兵ELISPOT和CLEIA檢測結(jié)果的關(guān)系

三、入伍新兵PPD試驗、ELISPOT和CLEIA檢測結(jié)果的比較

PPD試驗、ELISPOT和CLEIA法檢測同時陽性者有11例，同時陰性者有65名；3種方法中2種均陽性者有41例；1種方法為陽性者共有72例，其中PPD單陽35例，ELISPOT單陽28例，CLEIA單陽9例；2種IGRA方法聯(lián)合檢測的陽性率為43.82%(78/178)，在107名PPD陰性者中和71例PPD陽性者中2種IGRA方法聯(lián)合檢測的陽性率分別為39.25%(42/107)和50.70%(36/71)。3種檢測方法的一致率為42.70%(76/178)，三者的檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.3663，P<0.01)，結(jié)果見表5。

四、BCG接種對入伍新兵PPD試驗、ELISPOT和CLEIA檢測結(jié)果的影響

根據(jù)手臂上是否有卡痕來判斷是否接種了BCG。178名駐京部隊河南籍入伍新兵中有卡痕者96名(53.93%)，其中48例(50.00%)為PPD試驗陽性，22例(22.92%)ELISPOT檢測陽性，23例(23.96%)CLEIA檢測陽性，PPD試驗陽性率顯著高于2種IGRA法(χ2=20.6769，P<0.01)，但2種IGRA檢測陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.029，P>0.05)。82名(46.07%)無卡痕，其中23例(28.05%)PPD試驗陽性，39例(47.56%)ELISPOT檢測陽性，14例(17.07%)CLEIA檢測陽性；ELISPOT檢測的陽性率顯著高于CLEIA檢測和PPD試驗(χ2=18.3167，P<0.01)，但CLEIA與PPD試驗檢測的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.827，P>0.05)，結(jié)果見表6。

表5 2010年178名河南籍入伍新兵PPD試驗、ELISPOT和 CLEIA檢測結(jié)果比較

注 檢驗結(jié)果編號是指PPD試驗、ELISPOT和CLEIA 3種檢測結(jié)果的不同組合；“—” 代表陰性，“+” 代表一般陽性，“++”代表中度陽性，“+++”代表強(qiáng)陽性

討 論

近年來，通過檢測結(jié)核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ水平來診斷結(jié)核感染已經(jīng)被越來越多的國家所接受，與PPD試驗比較，該技術(shù)最大的優(yōu)勢在于能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和BCG接種引起的免疫應(yīng)答，而顯著提高了檢測的特異度，這對于BCG廣泛接種的國家和地區(qū)意義尤其重大。

表6 BCG接種對PPD試驗、ELISPOT和 CLEIA檢測結(jié)果的影響

一、PPD試驗和2種IGRA方法的檢測結(jié)果分析

本研究的入伍新兵均是健康人群，實際包括了三類人員：正常人、BCG接種者和結(jié)核潛伏感染者，其PPD試驗陽性率為39.89%，低于2003—2006年與2006—2009年駐京部隊入伍新兵的PPD試驗陽性率(分別為49.9%、53.1%)[10-11]；但本研究ELISPOT檢測的陽性率為31.46%，與筆者2009年應(yīng)用ELISPOT檢測的駐京部隊入伍新兵結(jié)核潛伏感染率相似(30.7%)[6]；應(yīng)用全血CLEIA法檢測的陽性率(21.35%)顯著低于PPD試驗和ELISPOT法，分析其可能原因如下：(1)用做抗原刺激劑的CFP10和ESAT6主要存在于結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌的基因組中，但在BCG和大多數(shù)環(huán)境結(jié)核分枝桿菌基因組中缺失RD1區(qū)，因此2種IGRA檢測不受BCG接種的影響[12-14]，其陽性率均顯著低于PPD試驗。(2)PPD反應(yīng)是通過激活中心記憶性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，它檢測的主要是以前的、休眠的結(jié)核分枝桿菌感染，它的反應(yīng)性比特異性IFN-γ反應(yīng)持續(xù)的時間更長，可能也是導(dǎo)致應(yīng)用PPD試驗檢測結(jié)核潛伏感染人群陽性率較高的原因之一[15]。(3)特異性IFN-γ應(yīng)答是依賴于抗原介導(dǎo)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的存在，檢測的是近期感染或“活動性”感染，IFN-γ的釋放會隨著結(jié)核分枝桿菌感染后時間的推移而逐漸地減弱，因此，2種IGRA法檢測結(jié)核潛伏感染人群的陽性率較低[16]。(4)由于檢測人群中包括BCG接種者，而本研究PPD試驗所采用的是卡介菌PPD，因此，PPD試驗陽性率顯著高于IGRA法的陽性率。(5)ELISPOT法檢測的陽性率顯著高于CLEIA法，從方法學(xué)上來說，其原因可能在于ELIPOT技術(shù)是從單細(xì)胞水平進(jìn)行檢測，可及時捕獲細(xì)胞周圍分泌的細(xì)胞因子，從25萬個PBMCs中檢出每個分泌IFN-γ的細(xì)胞，敏感度更高[17]。此外，ELISPOT法重點檢測活細(xì)胞的功能，即檢測單個細(xì)胞分泌IFN-γ的能力及分泌IFN-γ的細(xì)胞頻率；而CLEIA法是在群體細(xì)胞水平檢測IFN-γ的分泌情況，重點檢測IFN-γ的生成量，因此，結(jié)核潛伏感染者中雖然分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量較多，但分泌IFN-γ的水平較低。

二、PPD試驗結(jié)果對ELISPOT和CLEIA檢測的影響

PPD試驗陰性和陽性的新兵中ELISPOT檢測的陽性率分別為30.84%和32.39%，這與筆者課題組2009年的報道相似：在452例PPD試驗陰性和455例陽性者的駐京部隊入伍新兵中，分別有132例(29.2%)和146例(32.1%)ELISPOT檢測陽性[6]。2次研究結(jié)果表明，PPD試驗陰性和陽性者ELISPOT檢測的陽性率和斑點數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，再次證明ELISPOT檢測結(jié)果不受PPD試驗結(jié)果的影響。但PPD試驗陽性的新兵中CLEIA檢測陽性率顯著高于PPD試驗陰性的新兵，這與筆者課題組2011年的報道一致[9]，2次研究結(jié)果均表明，CLEIA檢測陽性率受PPD試驗結(jié)果的影響，這是因為PPD試驗陽性人群中包括結(jié)核潛伏感染者，其分泌IFN-γ的水平高于PPD試驗陰性人群。

三、PPD試驗與2種IGRA檢測結(jié)果的相關(guān)性

目前有許多研究顯示PPD試驗與IGRA結(jié)果之間的一致性差、相關(guān)性低[18-19]，這與本研究結(jié)果是一致的。這3種方法檢測機(jī)體免疫應(yīng)答的原理不同，ELISPOT檢測的是體外的致敏T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)；CLEIA檢測的是體外的致敏T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后分泌IFN-γ的水平；而PPD試驗的原理是遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，當(dāng)體內(nèi)致敏T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核分枝桿菌特異蛋白刺激時會釋放多種可溶性淋巴因子，導(dǎo)致血管通透性增加，巨噬細(xì)胞在局部集聚、浸潤，在注射部位出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)等變態(tài)反應(yīng)，其檢測的是72 h局部出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)反應(yīng)的平均直徑。本研究ELISPOT與PPD試驗檢測結(jié)果缺乏一致性，其效應(yīng)T細(xì)胞斑點數(shù)與PPD試驗硬結(jié)平均直徑之間也缺乏相關(guān)性，其原因在于雖然體外的致敏T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核特異性抗原刺激后釋放IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)增加了，但是并不意味著其促使巨噬細(xì)胞集聚、浸潤的反應(yīng)程度也能成比例的增強(qiáng)，一部分結(jié)核潛伏感染者巨噬細(xì)胞可能對IFN-γ反應(yīng)低或不反應(yīng)，而出現(xiàn)PPD試驗假陰性；此外，BCG接種者會導(dǎo)致PPD試驗假陽性。CLEIA檢測與PPD試驗之間的一致性雖然具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義，但Kappa值較小，一致率并不太高；CLEIA檢測的IFN-γ水平與PPD試驗反應(yīng)的硬結(jié)平均直徑之間的相關(guān)性也較低，其原因同上所述。

四、對2種IGRA檢測結(jié)果一致性的分析

本研究2種IGRA結(jié)果的一致性差，ELISPOT斑點數(shù)與CLEIA檢測的IFN-γ水平的相關(guān)系數(shù)較小，二者的相關(guān)性也較低。兩者的差異主要是發(fā)生在PPD陰性的人群中，分析其可能原因如下：(1)由于PPD試驗的敏感度低，導(dǎo)致部分結(jié)核潛伏感染者出現(xiàn)假陰性；而ELIPOT檢測的是外周血單個核細(xì)胞在結(jié)核特異性抗原刺激下釋放IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，因為其單個核細(xì)胞是定量的，所以排除了個體之間T細(xì)胞數(shù)量不同的影響，檢測的敏感度較高[20-21]；CLEIA檢測的是全血中致敏T細(xì)胞再次受到結(jié)核特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ水平，其單個核細(xì)胞是不定量的，且不同人的單個核細(xì)胞數(shù)也不同，其結(jié)果可能受到個體T細(xì)胞數(shù)量不同的影響，一部分T細(xì)胞數(shù)量較低或釋放IFN-γ較少的個體也可能出現(xiàn)假陰性，使CLEIA檢測的敏感度高于PPD試驗、低于ELISPOT；(2)潛伏感染人群中PPD陰性者可能是由于其體內(nèi)致敏T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核分枝桿菌特異蛋白刺激后釋放的細(xì)胞因子水平較低，不能引起血管通透性增加，也不能誘使巨噬細(xì)胞在局部集聚、浸潤；但ELISPOT方法可捕捉到釋放IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞，敏感度較高；而部分釋放低水平IFN-γ的潛伏感染者CLEIA檢測可能出現(xiàn)假陰性，這就導(dǎo)致了ELISPOT與CLEIA的檢測結(jié)果不完全一致。

五、BCG接種對PPD試驗、ELISPOT和CLEIA檢測結(jié)果的影響

我國新生兒第一針免疫接種的就是BCG，本研究結(jié)果顯示這批新兵的BCG接種率是53.93%。BCG接種人群PPD陽性率顯著高于2種IGRA試驗，而2種IGRA試驗的陽性率則相近。這可能是由于PPD含有結(jié)核分枝桿菌和BCG的共同抗原，而導(dǎo)致PPD試驗出現(xiàn)假陽性。由于做抗原刺激劑的CFP10和ESAT6基因主要存在于結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌基因組中，在BCG和大多數(shù)環(huán)境結(jié)核分枝桿菌基因組中RD1區(qū)缺失，因此2種IGRA試驗具有較高的特異度，不受BCG接種的影響[6,9]。

本研究無BCG接種人群ELISPOT試驗的陽性率均顯著高于PPD試驗和CLEIA方法，一方面說明ELIPOT對自然感染的檢出率高于PPD試驗和CLEIA，但也不排除假陽性的可能；另一方面說明PPD和CLEIA的敏感度不夠，可能存在假陰性的問題。BCG接種人群PPD陽性率顯著高于無BCG接種人群，說明部分人出生時接種的BCG仍有免疫原性；BCG接種人群ELISPOT的陽性率顯著低于無BCG接種人群，而CLEIA在有或無BCG接種人群中的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均說明BCG接種對這兩種IGRAs沒有影響。

六、關(guān)于2種IGRA方法聯(lián)合檢測結(jié)果的分析

兩種IGRA方法聯(lián)合檢測的陽性率為43.82%，略高于單獨PPD試驗的陽性率39.89%。其原因一方面是由于PPD試驗的敏感度不夠，目前PPD試驗的敏感度只有70%～80%[22]，存在假陰性；另一方面說明IGRA檢測結(jié)果可能存在假陽性問題。

PPD試驗檢測2010年河南籍駐京部隊入伍新兵結(jié)核潛伏感染的強(qiáng)陽性率為2.25%，比2003年至2006年駐京部隊入伍新兵的PPD試驗強(qiáng)陽性率(2.9%)略有降低[10]。

總之，2種IGRA方法與PPD試驗之間一致性差、相關(guān)性低。但I(xiàn)GRA方法不受卡介苗接種的影響，因此用IGRA方法能夠有效地篩查結(jié)核感染，而ELISPOT檢測的陽性率高于CLEIA。

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(本文編輯：薛愛華)

The results comparison of two methods of Interferon-γ release assays with PPD skin test in TB infection diagnosis

LIANG Yan, WANG Lan, ZHANG Cui-ying, WANG Zhi-yun, HOU Ying, YANG You-rong, ZHANG Jun-xian, ZHAO Wen-juan, WU Xue-qiong.

Army Tuberculosis Prevention and Control Key Laboratory, Beijing Key Laboratory of New Techniques of Tuberculosis Diagnosis and Treatment, Institute of Tuberculosis Research, the 309th Hospital of PLA, Beijing 100091, China

WU Xue-qiong, Email: wu-xueqiong@263.net

Objective To analyze the relevance and application value of 2 kinds of interferon gamma (IFN-gamma) release test (IGRA) and purified protein derivative (PPD) skin test. Methods A total of 178 new recruits to the army from Henan province received intradermally injected with purified protein derivative PPD skin test and to detect IFN-γ t lymphocytes in peripheral blood with enzyme linked-immunospot assay (ELISPOT) assay and IFN-γ in whole blood with chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) with recombinant CFP-10/ESAT-6 fusion protein (rCFP-10/ESAT-6) as a stimulus. Results The prevalence of Latent TB infection (LTBT), as estimated by PPD skin test, ELISPOT assay and CLEIA, was 39.89% (71/178), 31.46% (56/178) and 21.35% (38/178) of new recruits, respectively. The positive rate by PPD skin test is significant higher than that by two methods of IGRA (χ2=14.3663，P<0.01)，the positive rate by ELISPOT is significant higher than that by CLEIA (χ2=4.6834，P<0.05). Of 107 PPD-negative volunteers, 33 (30.84%) were ELISPOT-positive and 14 (13.08%) were CLEIA-positive, respectively, the positive rate by ELISPOT is higher than that by CLEIA (χ2=9.8425，P<0.01). Of 71 PPD-positive volunteers, 23 (32.39%) were ELISPOT-positive and 24 (33.80%) were CLEIA-positive, respectively, there was no statistically significant difference (χ2=0.0318，P>0.05). Agreement between PPD skin test and ELISPOT assay was 54.49% (97/178,U=0.218,P>0.05); agreement between PPD skin test and CLEIA was 65.73% (117/178,U=3.227,P<0.01); agreement between ELISPOT assay and CLEIA was 66.29% (118/178,U=1.885,P>0.05). Overall agreement among three tests was 42.70% (76/178). There was no correlation between spot formation cells detected by ELISPOT with average diameter detected by PPD skin test (r=0.138 51,P>0.05). There are low correlation between IFN-γ level detected by CLEIA with average diameter detected by PPD skin test(r=0.252 44，P<0.01); There are low correlation between spot formation cells detected by ELISPOT with IFN-γ level detected CLEIA (r=0.2755,P<0.01). 50.00% (48/96) of PPD-positive new recruits, 22.92% (22/96) of ELISPOT-positive new recruits and 23.96% (23/96) of CLEIA-positive new recruits found the BCG vaccination scars on their arms; while 28.05% (23/82) of PPD-positive new recruits, 47.56% (39/82) of ELISPOT-positive new recruits and 17.07% (14/82) of CLEIA-positive new recruits had not BCG scars. Conclusion There was low correlation and poor agreement between two methods of IGRA assays and PPD skin test, but IGRA may be more accurate methods for screening TB infection in countries with high coverage of BCG vaccination, the sensitivity of ELISPOT is higher than that of CLEIA.

Latent tuberculosis/diagnosis; Interferon-gamma release tests； Tuberculin test； Enzyme-linked immunospot assay； Immunoenzyme techniques

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.006

“十二五”國家重大科技專項(2013ZX10003003-005)；“十二五”全軍醫(yī)學(xué)科研重點項目(BWS11J050)；北京市科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展工程專項項目(Z141107004414021)

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點實驗室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點實驗室

吳雪瓊，Email：wu-xueqiong@263.net

2015-03-05)