王鎮(zhèn)南，唐 志，喻嫦娥，李淑慧，楊東紅 (廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524001)

鼻咽癌是嚴重威脅全球健康的常見的惡性腫瘤，許多國家在過去20 年內(nèi)發(fā)病率持續(xù)增長，由于鼻咽的解剖部位深在，解剖結(jié)構(gòu)復雜，病理主要為非角化型未分化癌以及易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，在初診的患者中，Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌約占總病例的60%左右［1－2］。目前，放射治療是無遠處轉(zhuǎn)移鼻咽癌首選和主要的治療方法，但晚期鼻咽癌(Ⅲ、Ⅳ期) 因易局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，5 年生存率約40%～70%［3］。因此，尋求高效、低毒的放療增敏劑成為研究的熱點。

鉑類藥物在細胞內(nèi)形成DNA 蛋白質(zhì)交聯(lián)，在DNA 中形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)，細胞通過修復這些交聯(lián)使DNA 鏈斷裂［4］。奈達鉑是第二代鉑類抗腫瘤藥物，胃腸道反應和腎毒性均明顯低于順鉑，本實驗將奈達鉑應用于鼻咽癌細胞上，通過觀測鼻咽癌細胞增殖、凋亡和周期的改變，探索奈達鉑對鼻咽癌細胞是否有放療增敏作用及其增敏的相關(guān)機制，為探索鼻咽癌治療的新策略提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 材料:人鼻咽癌CNE－2 細胞株由廣東醫(yī)學院病理教研室贈送，用含10%胎牛血清(Gibco 公司)的RMPI－1640 培養(yǎng)液(Gibco 公司)，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.1.2 試劑:NDP 購自南京先聲東元制藥有限公司，批號:11－120301，新生胎牛血清，RPMI－1640 細胞培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自Gibco 公司，細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購自凱基生物科技有限公司，CCK－8 試劑盒購自日本同仁化學研究所。

1.1.3 主要儀器:CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置顯微鏡(Olympus)，低速離心機(中佳光電)，酶標儀，流式細胞儀(美國Coulter 公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK－8 法檢測細胞增殖影響:取對數(shù)生長期的CNE－2 細胞以每孔1.0×105個細胞接種至96 孔板，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至60%～70%細胞融合后，加入含不同濃度的NDP(4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L、32 mg/L、64mg/L)新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，每個濃度設(shè)3 個復孔，同時設(shè)立對照組(沒有NDP處理)和空白組(沒有細胞);共同培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含CCK－8 10 μl 的100 μl 培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)孵育至培養(yǎng)液呈黃色;在酶標儀上測定每孔450 nm 吸光值(A)，計算不同濃度藥物的生長抑制率;計算公式:腫瘤細胞抑制率=(未處理組吸光值－藥物組吸光值)/未處理組吸光值。實驗重復3 次，取平均值分析各組細胞的生長抑制率。并計算IC50。

1.2.2 克隆形成試驗分析放射增敏作用:將細胞分組進行不同處理:對照組，NDP 組，單純放療組，NDP +放射組;其中對照組和NDP 組接種細胞數(shù)100 個，單純放療組和NDP+放射組則根據(jù)照射劑量的不同將不同數(shù)量(100，200，500，3 000，5 000，10 000)的細胞接種于不同的6 孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后依次進行不同劑量的照射(0、2、4、6、8、10 Gy)。照射源為(6 Mv X 線)直線加速器，距靶源100 cm，照射野大小為20×20 cm2，照射角度為180 度，把培養(yǎng)皿置于照射野中心照射，培養(yǎng)皿內(nèi)液體高度3 mm，培養(yǎng)皿底部加1 cm 厚補償膜;照射后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 天，以無水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，計數(shù)≥50 個細胞的克隆。根據(jù)各照射劑量點的存活分數(shù)作圖，利用單擊多靶模型方程擬合細胞存活曲線，求出D0，并計算放療增敏比(SER)。SER=D0 值(單純照射組)/D0值(照射加藥組)。

1.2.3 AnnexinV－FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡情況:將CNE－2 細胞種于6 cm 培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)至60%～70%細胞融合后，將細胞分成四個處理組:對照組，NDP 組，單純放療組，，NDP+放射組(單純放療組為單次射線照射4 Gy，NDP 組為其作用48 h，NDP 聯(lián)合放療組為單次射線照射4 Gy 后，NDP 繼續(xù)培養(yǎng)至48 h)。處理48 h 后，收集細胞，加入AnnexinV－FITC、PI 后，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。實驗重復3 次，取平均值分析各組細胞的凋亡率。

1.2.4 PI 法檢測細胞周期變化:將CNE－2 細胞種于6 cm 培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)至60%～70%細胞融合后，將細胞分成四個處理組:對照組，NDP 組，單純放療組，，NDP+放射組(單純放療組單次射線照射4 Gy，hTRR 組為其作用48 h，hTRR 聯(lián)合放療組為hTRR 培養(yǎng)48 h，4 Gy 射線照射)。處理48 h，收集細胞，70%冷乙醇500 微升固定，4 攝氏度保存過夜;重新收集細胞，加100 微升RNA 酶，37 攝氏度水浴反應30 分鐘;加入400 微升PI，避光反應30 分鐘;流式細胞儀檢測，實驗重復3 次，取平均值分析細胞周期。

2 結(jié)果

2.1 NDP 對CNE－2 細胞增殖的影響及IC50值:不同濃度NDP 作用CNE－2 細胞48 h 后，酶標檢測儀測定各孔的光吸度并計算其抑制率。藥物對細胞生長抑制作用如圖1、圖2 所示:NDP 呈劑量依賴性抑制鼻咽癌CNE－2 細胞的生長。且NDP 作用48 h 的50%抑制濃度IC50為32.576 mg/L。為減小NDP 本身對細胞生長的影響，以下試驗中選取1/5 的IC50(6.515 mg/L)濃度，觀察NDP 對CNE－2 細胞放射增敏作用、凋亡和周期分布改變的影響。

圖1 NDP 對鼻咽癌CNE－2 細胞的增殖抑制作用

圖2 NDP 抑制鼻咽癌CNE－2 細胞的增殖

2.2 NDP 聯(lián)合放療增強CNE－2 細胞的放射敏感性:按分組要求處理細胞，培養(yǎng)12 d 后，計算各處理組細胞的存活分數(shù)，見表1。采用Sigmaplot 10.0 軟件按單擊多靶模型SF=1－(1－e－D/D0)N擬合各組劑量存活曲線，見圖3，可得出各組N、Do、SF2 值，見表2，計算放射增敏比(SER)為:SER=Do(單純放射組)/Do(加藥后照射組)=1.542。

表1 NDP 聯(lián)合不豈劑量對CNE－2 細胞克隆形成的影響

表2 單純放射組和NDP 加放射組D0、N、SF2 值

圖4 單純放射組和NDP 加放射組D0、N、SF2 值

如圖3 所示，這種經(jīng)擬合得出的Do、N 和SF2 值，可從不同方面反應細胞的放射敏感性:Do 為平均致死劑量，為照射殺滅63%細胞所需的劑量，Do 越大，表示細胞放射抗拒性越強;N 值為外推值，反映細胞對放射引起損傷的修復能力，N 值越大表示細胞修復能力越強，殺死細胞所需射線劑量越大，放射抗拒性增強;2Gy 時存活分數(shù)SF2 是代表細胞放射敏感性的重要指標，其中SF2 越大，表示放射抗拒性越強。從存活曲線可以看出，NDP 能明顯增加CNE－2 細胞對放射的敏感性，放射增敏比(SER)為1.542。

2.3 NDP 聯(lián)合放療誘導CNE－2 細胞的凋亡:經(jīng)AnnexinVFITC 和PI 雙染后，正常的活細胞不被AnnexinV－FITC 和PI染色(左下象限)，凋亡早期的細胞僅被AnnexinV－FITC 染色，PI 染色呈陰性(右下象限)，壞死細胞和凋亡晚期的細胞可同時被AnnexinV－FITC 和PI 染色(右上象限)，左上象限出現(xiàn)的是許可范圍內(nèi)的誤差。處理48 h 后，計算早期和晚期凋亡率，結(jié)果如圖4、5 所示:與對照組相比，NDP 組、單放組及NDP 聯(lián)合放療組的細胞凋亡率皆增多，差異有統(tǒng)計學意義(F=277.76，P ＜0.01)，其中NDP+放療組誘導凋亡作用最明顯，凋亡率達(44.3±1.85)%，顯著高于NDP 組或單放組(P ＜0.01)，表明NDP 可顯著誘導CNE－2 細胞的凋亡，且NDP 聯(lián)合放療可增強誘導CNE－2 細胞凋亡。

圖5 CNE－2 細胞凋亡率

2.4 NDP 聯(lián)合放療對CNE－2 細胞周期的作用:細胞在兩次有絲分裂之間的時間被稱為細胞周期，處在增殖分裂過程的細胞首先經(jīng)歷G1期(DNA 合成前期)，RNA 迅速合成，并指導大量多種新蛋白質(zhì)和其他分子的合成。隨后進入S 期(DNA 合成期)，進行DNA 的復制。再之后是G2期(DNA 合成后期)，這是有絲分裂的準備期。然后是M 期(有絲分裂期)。細胞分裂周期不同時相是影響細胞放射敏感性的重要因素，處于分裂周期不同時相的細胞放射敏感性有很大的差異。有研究證實，鼻咽癌CNE2 細胞S 期細胞對放射抗拒，M 期和G2期的細胞放射敏感性高，細胞G1/G0期較長，G1早期放射抗拒，G1晚期放射敏感。

實驗結(jié)果如表3 和圖6 所示，對照組細胞大部分處在G1/G0期，其次是S 期，G2/M 期細胞只占少量。單純照射組產(chǎn)生明顯的G2期阻滯，G2/M、S 期細胞比例增加，G1/G0期比例降低。單純放射組S 比例增大可能是細胞受放射損傷后，對放射線不敏感的S 期細胞存活，S 期細胞比例相對增加。單純NDP組G2/M、S 期細胞比例與對照組無明顯差異，NDP 聯(lián)合放療與單純放療相比，G2/M、S 期細胞也無明顯差異。因此，本試驗結(jié)果顯示，NDP 對CNE－2 細胞周期分布的改變無明顯影響。

表3 NDP、放療對CNE－2 細胞周期分布的影響(%)

圖6 PI 單染檢測細胞周期

3 討論

奈達鉑化學名為順－甘醇酸二氨合鉑，由日本鹽野義制藥公司研發(fā)，1995 年6 月在日本上市，是順鉑的類似物，但胃腸道和腎毒性均明顯低于順鉑，且部分對順鉑耐藥的患者，改用奈達鉑后仍可取得一定的療效［5］。臨床上主要用于食管癌、肺癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、宮頸癌等實體腫瘤的治療［6－10］。

腫瘤細胞的增殖周期是指一個細胞株倍增時間，腫瘤細胞的生長速度與細胞增殖周期時間長短有關(guān)。來源相同的腫瘤細胞和正常細胞相比較，周期經(jīng)歷的時間大致上是一樣的，但腫瘤細胞以不受機體控制的方式增殖，細胞數(shù)量也不斷地無限制地增加［11］。因此，抗腫藥物瘤抑制腫瘤細胞的增殖對腫瘤治療起著非常重要的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，NDP 呈劑量依賴性抑制鼻咽癌CNE－2 細胞的生長，在NDP 濃度64 mg/L 時，抑制率達(91±1.68)%，且NDP 作用48h 的50%抑制濃度IC50 為32.576 mg/L。為了減小NDP 本身對細胞生長的影響，選取1/5的IC50(6.515 mg/L)濃度進行凋亡、周期和克隆形成的實驗研究。

輻射能(mdiant eneFgy)是射線本身具有的能量，是放療發(fā)揮抗癌作用的關(guān)鍵，即當細胞吸收任何形式的輻射能量后，射線與細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)發(fā)生作用而間接或者直接地損傷細胞DNA，引起細胞死亡［12］。直接損傷表現(xiàn)在射線直接作用于DNA，引起DNA 分子出現(xiàn)交聯(lián)、斷裂［13］。間接損傷表現(xiàn)在射線對人體組織間液發(fā)生電離，產(chǎn)生自由基，產(chǎn)生的自由基再和生物大分子發(fā)生作用，形成不可逆損傷，引起細胞死亡［14］。因而，影響放射效應的因素都是和這2 種效應有關(guān)系的因素。主要有放射損傷修復能力、氧效應(oxygen effect)以及存在輻射耐受細胞等因素［15］。放療后引起的細胞損傷修復能力的大小可以經(jīng)N 值來判斷，N 增大表示細胞修復能力增強，殺死細胞所需劑量增大，放射抗拒性增強［16］;本試驗經(jīng)細胞存活曲線證實了NDP 對CNE－2 細胞的放射增敏作用，從細胞存活曲線的參數(shù)來看，NDP+放射組的N 值明顯小于單純放療組，D0 和SF2 值也小于單純放療組，放射增敏比為1.542。說明NDP+放療能降低細胞的損傷修復，從而使細胞存活分數(shù)降低。是奈達鉑放療增敏的一種機制。

隨著腫瘤形成機制以及放射和藥物作用機制的闡明，放療增敏的概念已包括細胞微環(huán)境，血管形成，放射所致細胞信號轉(zhuǎn)導過程，DNA 損傷和細胞周期紊亂、凋亡、分化等多個非常復雜的領(lǐng)域［17］。目前，放射增敏主要集中在基因水平和放射增敏劑兩個方面［18］。放射增敏劑有鉑類藥物、抗代謝藥物、紫杉烷類和微管穩(wěn)定藥物、靶向藥物等［19］。奈達鉑是新一代鉑類抗腫瘤藥物，其進入細胞后，甘醇酸酯配基上的醇性氧與鉑之間的鍵斷裂，鉑與水結(jié)合形成多種離子型物質(zhì)，以與順鉑相同的方式和DNA 結(jié)合，抑制DNA 的復制或通過自由基形成而產(chǎn)生毒性中間產(chǎn)物發(fā)揮抗腫瘤作用［20］。本研究得出，與對照組相比，奈達鉑組、單放組及奈達鉑聯(lián)合放療組的細胞凋亡率皆增多，其中NDP 組、單純放療組凋亡率為(30.4+2.17)%、(22.7+2.24)%(P ＜0.05)，NDP 加放療組凋亡率最高，顯著高于NDP組或單放組，為(44.3+1.85)%(P ＜0.01)。表明NDP 可顯著誘導CNE－2 細胞的凋亡，且NDP 聯(lián)合放療可增強誘導CNE－2 細胞凋亡。凋亡被認為是一種重要的放射敏感性指標，有文獻報道，放療是通過誘導凋亡發(fā)生來達到治療目的的［21－22］。如上所述，NDP 可顯著誘導CNE－2 細胞的凋亡，說明通過誘導凋亡增加而增加細胞對放射線的敏感性是奈達鉑對鼻咽癌放射增敏的一種機制。

根據(jù)奈達鉑抗腫瘤作用機制是引起雙鏈DNA 破裂，對放射線最不敏感的S 期細胞應該明顯減少，但本實驗結(jié)果顯示，單純NDP 組G2/M、S 期細胞比例與對照組無明顯差異，NDP 聯(lián)合放療與單純放療相比，G2/M、S 期細胞也無明顯差異。因此，本研究表明NDP 對CNE－2 細胞周期分布的改變無明顯影響。奈達鉑是否會通過改變周期分布起放射增敏有待進一步的研究。

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