馮 杉，李賽楠，江林芡，常艷旭，馬 琳

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

甘草對(duì)液體發(fā)酵中槐耳菌絲體生長(zhǎng)及多糖影響初探*

馮 杉，李賽楠，江林芡，常艷旭，馬 琳

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

[目的]以槐耳菌絲體生物量及多糖為主要指標(biāo),探究槐耳-甘草液體共發(fā)酵中最佳甘草的添加量和發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。[方法]采用液體發(fā)酵技術(shù)，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甘草提取液，共發(fā)酵獲得槐耳-甘草共發(fā)酵產(chǎn)物，苯酚-硫酸法及DNS法結(jié)合測(cè)定多糖含量。[結(jié)果]槐耳-甘草液體共發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，添加甘草8 g/L、發(fā)酵終點(diǎn)設(shè)為192 h時(shí)，槐耳生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值。[結(jié)論]運(yùn)用槐耳-甘草液體共發(fā)酵可以提高槐耳生物量及多糖的含量，為深入研究槐耳-甘草液體共發(fā)酵機(jī)制提供了理論依據(jù)。

槐耳；液體發(fā)酵；多糖

槐耳，又名槐栓菌（Trametes robiniophila Murr.），為非褶菌目、多孔菌科、栓菌屬真菌子實(shí)體[1]，是中國(guó)民間重要的藥用真菌之一。它在治療和輔助治療腫瘤方面有十分顯著的療效[2-6]，主要生理活性物質(zhì)為槐耳多糖[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)利用發(fā)酵技術(shù)獲得槐耳菌絲體具有與槐耳子實(shí)體相同功效[9-10]，因此，采用槐耳液體發(fā)酵提高槐耳多糖的產(chǎn)量、代替子實(shí)體應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)成為可能。甘草（Glycyrrhizae Radix）為豆科植物甘草的干燥根及根莖，具有抗炎、抗癌、保肝等功效[11-12]。利用槐耳生長(zhǎng)過(guò)程中的分解合成代謝作用，使甘草原有活性成分轉(zhuǎn)化，合成自身活性物質(zhì)，有可能產(chǎn)生新成分和新功能[13-14]，并增強(qiáng)槐耳的特殊療效。本實(shí)驗(yàn)初步探討甘草對(duì)槐耳發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生長(zhǎng)和多糖產(chǎn)量的影響，為中藥轉(zhuǎn)化槐耳的新型發(fā)酵研究提供借鑒。

1 儀器與材料

1.1 供試菌種及藥材 槐栓菌（Trametes robiniophilaMurr.）菌種，由南京中醫(yī)藥大學(xué)莊毅教授提供。甘草（Glycyrrhizae Radix），購(gòu)置于北京同仁堂藥店。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 葡萄糖（AR，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠），苯酚（AR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），濃硫酸（AR，天津市化學(xué)試劑供銷公司），3，5－二硝基水楊酸（AR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），蛋白胨（BR，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），瓊脂粉（BR，天津市英博生化試劑有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ－LS－50SII，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），潔凈工作臺(tái)（JB－CJ－2FXS，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），立式搖床（SYC－C，上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司），pH計(jì)（pHS－25，上海雷磁儀器廠），低速離心機(jī)（LD5－2A，北京京立離心機(jī)有限公司），雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU－1901，北京普析通用儀器有限公司）。

1.4 培養(yǎng)基配方綜合PDA培養(yǎng)基[15]（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，g/L）：馬鈴薯 200、葡萄糖 20、瓊脂15、磷酸二氫鉀（KH2PO4）3.0、硫酸鎂（MgSO4）1.5、VB10.006，pH自然。液體菌種培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨 3.0、KH2PO43.0、MgSO41.5、VB10.008，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨4.0、KH2PO43.0、MgSO41.5，VB10.008、甘草提取液適量，pH自然。

2 方法與結(jié)果

2.1 槐耳液體菌種的制備 取活化[16]好的槐耳母種，無(wú)菌條件下切割成0.5 cm2大小菌塊，接種于液體菌種培養(yǎng)基中，放置于旋轉(zhuǎn)式搖床中，轉(zhuǎn)速150 r/min，27℃暗培養(yǎng)5 d，連續(xù)傳代2次至菌液清亮，菌球細(xì)小稠密、大小均勻，備用。

2.2 甘草的預(yù)處理 甘草飲片粉碎，過(guò)60目篩。取甘草粉末30.00 g，按1∶8加水浸泡1 h，微沸狀態(tài)提取30min，重復(fù)提取3次，提取液過(guò)濾。合并3次提取液并濃縮至一定體積，備用。

2.3 甘草添加量對(duì)槐耳生物量的影響 在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同量的甘草水提液，作為藥性培養(yǎng)基，以不添加甘草水提液為空白對(duì)照培養(yǎng)基。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，接種，于27℃搖床中暗培養(yǎng)6 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心，沉淀用蒸餾水沖洗3次，于60℃烘箱中烘干至恒重。結(jié)果顯示當(dāng)甘草添加量為8 g/L時(shí)，槐耳菌絲體生物量最大?；倍z體生物量變化見(jiàn)圖1。

圖1 甘草添加量對(duì)槐耳生物量的影響Fig.1 Effectsof Radix G lycyrrhizae contentson biomassof Trametes robiniophila

2.4 甘草槐耳共發(fā)酵生物量隨發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)的變化 以添加8 g/L甘草的液體發(fā)酵培養(yǎng)基作藥性培養(yǎng)基，不添加甘草為空白對(duì)照，接種并培養(yǎng)。每48 h取樣1次，測(cè)定菌絲體干濕重，結(jié)果見(jiàn)圖2。在槐耳液體發(fā)酵初期，0～48 h時(shí)間段內(nèi)甘草組與空白組的生物量相差不大。發(fā)酵進(jìn)行48 h，槐耳菌絲體生長(zhǎng)速率顯著增加，自此，甘草組槐耳菌絲體生物量一直明顯高于空白組；并且甘草組槐耳菌絲體生物量在發(fā)酵進(jìn)行192 h達(dá)到最高值，相比空白組延遲48 h，此時(shí)生物量接近空白組槐耳菌絲體生物量的2倍。

2.5 甘草對(duì)槐耳發(fā)酵產(chǎn)生多糖的影響

2.5.1 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量 以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸法[17-19]測(cè)定多糖含量。精密稱取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10.00mg，加水溶解并定溶于100mL容量瓶中，搖勻，制成每1mL含0.1mg的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液一定體積于10mL具塞試管中，搖勻，再加水至2.0mL，另取2mL蒸

圖2 槐耳發(fā)酵過(guò)程中干濕重的變化Fig.2 Changesof dry and wetweight in Trametes robiniophila fermentation

餾水為空白對(duì)照，依次加入1.0mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速滴加濃硫酸各5mL，搖勻放置5min，置沸水浴中加熱15min，再冰水冷卻至室溫，紫外分光光度法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度。

2.5.2 線性關(guān)系考察 依次精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液表1中體積，按照2.5.1中步驟測(cè)定吸光度，以吸光度為A縱坐標(biāo)，濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程=60.224X+0.026 1（r＝0.999 4），線性范圍為 2.5～20.0mg/L。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸取體積和吸光度Tab.1 Volume and absorption ofglucose standard solution

2.5.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取樣品溶液2.0mL，按照2.5.1項(xiàng)下方法操作，連續(xù)重復(fù)6次測(cè)定吸光度，RSD（n＝6）為 0.07%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取樣品溶液2.0mL，按照 2.5.1 項(xiàng)下方法操作，分別在 0、15、30、45、60、75min測(cè)定吸光度，顯色在 75min 內(nèi)較穩(wěn)定，RSD（n＝6）為0.40%。

2.5.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 同批樣品重復(fù)測(cè)定6次，RSD（n＝6）為1.67%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取總糖含量為25.8μg的樣品溶液9份，分別精密加入相當(dāng)于樣品溶液中總糖含量的80%、100%、120%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，制成高、中、低3個(gè)濃度組，每個(gè)濃度各分別制備3份供試品溶液，按2.5.1項(xiàng)下方法操作，平均加樣回收率為108.97%，RSD（n=9）為3.03%。

2.5.7 多糖測(cè)定 按照2.3和2.4項(xiàng)條件培養(yǎng)獲得不同發(fā)酵工藝的干燥菌絲體。研細(xì)后加入20倍體積蒸餾水超聲提取1 h，離心，收集上清液。以苯酚-硫酸法測(cè)定槐耳-甘草液體共發(fā)酵胞內(nèi)多糖含量。添加8 g/L甘草，槐耳產(chǎn)生多糖量最多；且發(fā)酵終點(diǎn)較未添加甘草的空白組延后96 h。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 甘草添加量對(duì)槐耳多糖的影響Fig.3 Effectsof Radix G lycyrrhizae contentson polysaccharideof Trametes robiniophila

圖4槐耳發(fā)酵過(guò)程中多糖含量的變化Fig.4 Changesof polysaccharide contents in Trametes robiniophila fermentation

3 討論與結(jié)論

甘草對(duì)槐耳菌絲體發(fā)酵具有顯著影響，能促進(jìn)菌絲體的生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖的生成。隨甘草添加量的增加，槐耳菌絲體生物量與胞內(nèi)多糖含量也相應(yīng)呈增加的趨勢(shì)；但當(dāng)甘草添加量大于8 g/L，槐耳生物量和胞內(nèi)多糖含量開始下降。因此，實(shí)驗(yàn)選擇8 g/L的甘草添加量進(jìn)行后續(xù)研究。

槐耳菌絲體生長(zhǎng)大致經(jīng)歷3個(gè)階段：適應(yīng)期、快速生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期，呈現(xiàn)“S”型生長(zhǎng)趨勢(shì)。發(fā)酵初期，槐耳處于適應(yīng)期，菌絲體的生長(zhǎng)和代謝不旺盛，生物量增長(zhǎng)較緩慢。隨后槐耳進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，此時(shí)槐耳適應(yīng)了培養(yǎng)條件，菌絲體生長(zhǎng)加速。甘草對(duì)槐耳菌絲體生長(zhǎng)具有較大的促進(jìn)作用，并能延長(zhǎng)槐耳快速生長(zhǎng)期，從而使得槐耳-甘草共發(fā)酵時(shí)，菌絲體生物量以及多糖產(chǎn)量顯著增加。生物量達(dá)峰值以后，隨著培養(yǎng)基中酸度的增加、營(yíng)養(yǎng)成分的缺乏及平均生存空間的減小，菌絲體出現(xiàn)衰亡、自溶現(xiàn)象，生物量開始下降，槐耳進(jìn)入衰亡期。槐耳-甘草共發(fā)酵發(fā)酵192 h進(jìn)入衰亡期，此時(shí)槐耳菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量開始有所下降，因此，以192 h作為槐耳-甘草共發(fā)酵的發(fā)酵終點(diǎn)較為合理。

本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，此方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適用于雜質(zhì)種類少、含量低等情況下多糖的測(cè)定。一般多糖的測(cè)定采用比色法，主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其原理為多糖水解生成的單糖可與強(qiáng)酸產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，通過(guò)顯色劑所合成有色的絡(luò)合物比色定量。有研究表明，蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性低于苯酚-硫酸法[20]。若要排除還原型雜質(zhì)的干擾，還可結(jié)合3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）測(cè)定還原糖含量。此外，還有學(xué)者利用高效液相色譜法[21]、氣相色譜法等測(cè)定多糖含量，方法更加快速、準(zhǔn)確，并且能有效的避免傳統(tǒng)方法因多糖水解不完全而產(chǎn)生的誤差。

上述研究表明，液體培養(yǎng)基中甘草水提液添加量在8 g/L左右時(shí)對(duì)槐耳生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量具有顯著的促進(jìn)作用，槐耳-甘草共發(fā)酵培養(yǎng)的最佳發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為192 h?；倍?甘草液體共發(fā)酵可以提高槐耳生物量及多糖的含量，但甘草對(duì)槐耳發(fā)酵的作用機(jī)制尚不明確，這些工作有待進(jìn)一步的深入研究探討。

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Prelim inary study on the impactof Glycyrrhizae Radix on the growth of Trametes robiniophila mycelium and

polysaccharide in liquid fermentation FENGShan,LISai-nan,JIANG Lin-qian,CHANGYan-xu,MA Lin
（Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To explore the bestaddition amount of Glycyrrhizae Radix and fermentation time of the liquid fermentation ofTrametes robiniophila-Glycyrrhizae Radix,withmycelialbiomassand fungipolysaccharide as themain indicators.[Methods]MycelialofTrametes robiniophilawas obtained in liquid fermentation,with Glycyrrhizae Radix added to liquid fermentationmedium.The contentof polysaccharideswas determined by phenol-sulfuric acid method and DNSmethod.[Results]The bestaddition amountof Glycyrrhizae Radixwas8 g/L and the best fermentation timewas192 hwhen the biomassand polysaccharide ofTrametes robiniophilagot to themaximum.[Conclusion]UsingTrametes robiniophila-Glycyrrhizae Radix liquid fermentation could increase themycelial biomass and the contentof intracellular and extracellular polysaccharides ofTrametes robiniophila.It provides a theoreticalbasis for improving the yield of liquid fermentation.

Trametes robiniophila;liquid fermentation;polysaccharide

R282.71

A

1672-1519（2015）09-0563-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.09.14

國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作項(xiàng)目（2007FY110600）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（810001632）；國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目資助（81374050）。

馮 杉（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幧锕こ獭?/p>

馬 琳，E-mail:malin7983@163.com。

2015-03-29）

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