王穎，底婷婷，阮智通，趙京霞△，李萍△

(1首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，2北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

涼血解毒湯對銀屑病小鼠皮膚組織CCL20/CCR6表達的影響*

王穎1，2，底婷婷2，阮智通1，2，趙京霞2△，李萍1，2△

(1首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，2北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

目的:觀察涼血解毒湯對銀屑病小鼠皮膚組織中CC趨化因子配體20(CCL20)/CC趨化因子受體6(CCR6)表達的干預作用。方法:24只BALB/c雄性小鼠隨機分為空白對照組、銀屑病模型組、涼血解毒湯中藥治療組和趨化因子CCL20單克隆抗體(陽性藥)治療組。用咪喹莫特誘導小鼠銀屑病模型，采用銀屑病皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分標準觀察銀屑病樣小鼠皮損的變化情況。光鏡下觀察皮損組織形態(tài)學變化，測量表皮層厚度。采用real－time PCR檢小鼠皮膚組織樣本中CCL20和CCR6表達的變化。結(jié)果:銀屑病模型組小鼠皮膚出現(xiàn)大量鱗屑和紅斑，表皮增厚;與銀屑病模型組小鼠比較，涼血解毒湯組小鼠銀屑病樣皮損程度較輕，紅斑、鱗屑以及表皮增厚程度輕于模型組，PASI分數(shù)降低，皮膚組織CCL20以及CCR6的表達明顯低于模型組。趨化因子CCL20單克隆抗體治療組小鼠銀屑病皮損程度較輕，紅斑、鱗屑以及表皮增厚程度輕于模型組，PASI分數(shù)降低，皮膚組織CCL20以及CCR6的表達明顯低于模型組。結(jié)論:涼血解毒湯可能通過下調(diào)CCL20/CCR6的表達來減輕銀屑病小鼠的皮膚病變。

銀屑病;CC趨化因子配體20;CC趨化因子受體6;涼血解毒湯

銀屑病(psoriasis)是一種多基因決定、多環(huán)境因素刺激誘導的免疫異常性、慢性炎癥性增生性皮膚?。?］，中醫(yī)學稱之“白疕”，典型皮損為境界清楚的具有銀白色鱗屑的紅色斑塊，輕者可以在四肢關節(jié)部位出現(xiàn)銀幣大小的斑塊，重者可以累及全身。病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞異常增生伴有角化不全以及炎性細胞浸潤和新生血管形成［2］?；罨慕琴|(zhì)細胞產(chǎn)生的CC趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20，CCL20)及CC趨化因子受體6(CC chemokine receptor 6，CCR6)可以介導免疫細胞向皮損部位遷移并誘導分泌促炎因子從而加重銀屑病皮損［3］。涼血解毒湯(Liangxue－Jiedu prescription，LXJD prescription)是中醫(yī)針對銀屑病血熱證的有效方劑，但其治療銀屑病的作用機制尚缺乏充分研究。本研究擬通過涼血解毒湯干預咪喹莫誘導的銀屑病小鼠，檢測小鼠皮損處的變化以及與CCL20/CCR6軸的關系，進而闡述涼血解毒湯對CCL20/CCR6軸變化的影響及其治療銀屑病的作用機制。

材料和方法

1 實驗動物

BALB/c小鼠，雄性，體重18～20 g，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證編號為SCXK(京)20090007。在三級動物室無菌飼料喂養(yǎng)。

2 主要試劑和藥物

5%咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責任公司出品)，CCL20單抗(Abcam)，凡士林(河北蘭煉飛天石化有限公司產(chǎn)品)，超純RNA提取試劑盒，HiFi－MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒，UltraSYBR Mixture (With ROX)，DNase I，5×RNA Loading Buffer。涼血解毒湯來源于北京中醫(yī)醫(yī)院協(xié)定處方(土茯苓30 g、生槐花15 g、紫草10 g、草河車9 g、生地黃15 g、白鮮皮10 g、赤芍10 g、雙花15 g、白茅根30 g、苦參10 g，各味中藥飲片由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供)。

3 主要儀器

PCR儀、紫外分光光度計、凝膠電泳成像系統(tǒng)、高速冷凍離心機、超低溫冰箱、脫水機、包埋機、石蠟切片機、圖像分析系統(tǒng)等設備。

4 動物模型的建立與分組

24只小鼠編號稱重后隨機分為4組，每組6只，分別為空白對照(control)組:背部涂抹凡士林并灌胃蒸餾水(0.4 mL/d);銀屑病模型(model)組:背部涂抹5%咪喹莫特乳膏25 mg并灌胃蒸餾水(0.4 mL/d);LXJD治療組:背部涂抹5%咪喹莫特乳膏25 mg并灌胃涼血解毒湯(1 mg/kg，0.4 mL/d);CCL20單克隆抗體(陽性藥)治療組:背部涂抹5%咪喹莫特乳膏25 mg并背部注射CCL20單抗試液0.1 mL/ d。實驗前用戊巴比妥鈉按照80 mg/kg體重將小鼠進行腹腔麻醉，背部去毛后單籠飼養(yǎng)。中藥組于造模次日起灌胃給藥，模型組于造模次日起灌胃等量蒸餾水，每天2次，連續(xù)給藥7 d，CCL20單克隆抗體治療組背部注射CCL20抗體0.1 mL(濃度為30 mg/ L)。所有小鼠于造模第8天取背部皮損用于后續(xù)檢測。

5 檢測指標與方法

5.1 小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分根據(jù)肉眼觀察模型制備后各組小鼠皮損的變化情況，每天用相機記錄變化情況。依據(jù)PASI評分標準給予小鼠相應紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度的積分，將3者積分相加得到總積分，觀察小鼠皮損的變化情況。

5.2 銀屑病樣小鼠組織學的觀察于給藥后第8天取小鼠背部皮損組織，10%甲醛固定，石蠟包埋切片。經(jīng)HE染色觀察創(chuàng)面的組織學變化，分析圖像，繪制表示皮損增厚程度的柱狀圖。

5.3 小鼠銀屑病皮損CCL20和CCR6 mRNA表達的檢測采用real－time PCR法檢測。用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，用HiFi－MMLVcDNA第1鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取5 μL cDNA用熒光染料UltraSYBR Mixture嵌合熒光法進行PCR擴增，以β－actin為內(nèi)參照。擴增程序為:95°10 min;95℃15 s，60℃60 s，45個循環(huán)。擴增產(chǎn)物取5μL行1%瓊脂糖凝膠電泳，選取樣本cDNA進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參照基因引物進行擴增，同時在60～95℃進行融解曲線分析，結(jié)果顯示各標準曲線的R2均達到0.99，說明線性相關度很高，且擴增效率均在90%以上。CCL20上游引物為5’－CAGCCAGGCAGA AGCAGCAA－3’，下游引物為5’－GGCCATCTGTCTTGTGAAACCCA－3’，產(chǎn)物大小100 bp;CCR6上游引物為5’－CCGTGTTGTATGCGTTTATTGGAC－3’，下游引物為5’－CCTTCTCATACACCACACATCCTTCA－3’，產(chǎn)物大小80－bp;β－actin上游引物為5’－GCCTTCCTTCTTGGGTA－3’，下游引物為5’－GGCATAGAGGTCTTTACGG－3’，產(chǎn)物大小97 bp，引物由北京金唯智生物科技有限公司合成，PCR采用ABI 7500型熒光定量PCR儀進行。采用2－ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析涼血解毒湯對小鼠銀屑病皮損CCL20/CCR6 mRNA表達的影響。

6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)。PASI評分以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))［median(Q1，Q3)］表示，并采用秩和檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 涼血解毒湯對銀屑病樣小鼠皮損的影響

1.1 肉眼觀察如圖1所示，對照組小鼠背部皮膚光滑，無增厚，紅斑以及脫屑。銀屑病模型組小鼠咪喹莫特涂抹的第2天背部皮膚開始增厚，出現(xiàn)淡粉色紅斑以及褶皺，第3天開始背部皮膚增厚程度加重，頸部皮膚開始出現(xiàn)少量銀屑，此后皮膚持續(xù)增厚，紅斑面積增大，鱗屑增多，至第8天開始背部皮膚顯著增厚，皮膚出現(xiàn)大面積紅斑并伴有大量脫屑。CCL20單克隆抗體治療組小鼠第2天背部皮膚開始增厚，程度不及模型組，第3天開始背部皮膚出現(xiàn)明顯紅斑以及少量脫屑，程度不及銀屑病模型組，至第8天開始小鼠皮膚增厚，少量紅斑伴有脫屑，程度均不及銀屑病模型組。LXJD治療組小鼠第2天開始背部皮膚增厚，程度不及銀屑病模型組，第3天開始背部皮膚出現(xiàn)紅斑以及頸部皮膚出現(xiàn)脫屑，程度不及銀屑病模型組。各小組PASI積分趨勢見圖2。

Figure 1.Effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription on mouse psoriasis－like skin lesions induced by imiquimod.圖1 涼血解毒湯對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮損的影響

1.2 涼血解毒湯對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損組織學變化的影響如圖3所示，在各組治療的第8天，空白對照組小鼠皮膚表皮層薄，無明顯分層，皮下淋巴細胞浸潤較少。銀屑病模型組小鼠皮膚表皮層顯著增厚，厚度約為空白對照組的6～7倍左右，表皮出現(xiàn)明顯分層，棘細胞層和顆粒層顯著增厚，基底層細胞緊密排列，可見角化不全、Munro膿腫、鱗屑等，皮下大量淋巴細胞浸潤。CCL20單克隆抗體治療組小鼠皮膚表皮層厚度較空白對照組增厚，約為對照組2～3倍左右，而模型組厚度為其一半左右，棘細胞層和顆粒層分層不顯著，厚度約為模型組一半，皮下淋巴細胞浸潤較輕。LXJD治療組小鼠皮膚表皮層增厚程度與陽性藥物組相似，棘細胞層和顆粒層分層不顯著，皮下淋巴細胞浸潤較輕。

通過測量表皮垂直厚度發(fā)現(xiàn)，銀屑病模型組增厚顯著，約為對照組的6～7倍，LXJD治療組以及CCL20單克隆抗體治療組增厚程度不及模型組，與空白組相比，增厚程度約為3倍左右，與銀屑病模型組相比增厚程度顯著降低(P＜0.01)，與CCL20單克隆抗體治療組相比無顯著差異，見圖4。

Figure 2.Effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription on PASI scores of mouse psoriasis－like skin lesions induced by imiquimod.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs model.圖2 涼血解毒湯對銀屑病樣小鼠皮損PASI評分的影響

Figure 3.Effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription on histology changes of mouse psoriasis－like skin lesions induced by imiquimod(HE staining，×200).Δ indicates Munro microabscesses.圖3 涼血解毒湯對銀屑病樣小鼠皮損病理學改變的影響

2 涼血解毒湯對銀屑病樣小鼠皮損CCL20和CCR6 mRNA表達的影響

與空白對照組小鼠皮膚組織相比，模型組小鼠皮損中CCL20 mRNA表達量顯著升高(P＜0.05)，約為空白對照組的2倍，陽性藥物組以及中藥治療組小鼠皮損中CCL20 mRNA表達量與空白對照組相比無明顯差異;與模型組相比，中藥治療組以及陽性藥組CCL20 mRNA均有所降低，約為模型組的60%～70%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而中藥組與陽性藥組比較CCL20 mRNA表達差異不顯著。與空白對照組小鼠皮膚組織相比，模型組小鼠皮損中CCR6 mRNA表達量升高不明顯，而陽性藥物組以及中藥治療組的小鼠皮損中CCR6 mRNA表達量與空白對照組相比有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義，與模型組相比，中藥治療組以及陽性藥組CCR6 mRNA均有所降低，約為模型組的一半，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而中藥組與陽性藥組比較CCR6 mRNA表達差異不顯著，見圖5。

討論

銀屑病是一種以T淋巴細胞活化和浸潤為主要特征的慢性炎癥反應性疾病，發(fā)病原因多樣，涉及遺傳、免疫、環(huán)境及精神等多種因素［2］。目前銀屑病已經(jīng)被定義為由Th17細胞介導的自身免疫性疾病，Th17細胞在IL－23的誘導下可以增殖、活化并分泌多種炎性細胞因子從而誘發(fā)銀屑病等多種自身免疫性炎性損傷［4］。研究表明，銀屑病患者皮損中有大量的Th17細胞浸潤，血清中Th17細胞數(shù)量和Th17類細胞因子水平明顯升高，且與病情嚴重程度相關［5］。有相關研究提示，Th17細胞向靶皮損的遷移及浸潤是銀屑病最早發(fā)生的生物學過程［6］。

表1 治療第8天小鼠PASI評分Table 1.The PASI scores of mouse psoriasis－like skin lesin at day 8 of treatment(Mean±SD.n=6)

Figure 4.Comparison of epidermal thickness in skin lesions at day 8 of treatment.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs model.圖4 治療第8天垂直測量小鼠表皮厚度

Figure 5.CCL20/CCR6 mRNA expression in mouse psoriatic lesions at day 8 of treatment.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs model.圖5 治療第8天小鼠銀屑病皮損CCL20/CCR6 mRNA表達的檢測

趨化因子是一組具有趨化作用的細胞因子，能吸引免疫細胞到免疫應答局部，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應。CCL20作為β趨化因子家族中的一員，主要由角質(zhì)形成細胞分泌，具有趨化淋巴細胞的作用，對中性粒細胞幾乎無趨化作用，在一般情況下，可以在外周血淋巴細胞、淋巴結(jié)、肝臟、闌尾以及腸道等組織中檢測到其表達［7］。CCL20可以在皮膚組織中角質(zhì)形成細胞、皮膚成纖維細胞、皮膚微血管內(nèi)皮細胞以及樹突狀細胞中表達，多項研究已經(jīng)證實，在正常皮膚中，角質(zhì)形成細胞低水平表達CCL20，而在銀屑病皮損中，CCL20在表皮基底層呈高度表達，與病損嚴重程度相關，并且受TNF－α、IL－1β、IL－17等炎癥因子的影響。目前已經(jīng)證實CCL20對樹突狀細胞和T細胞的定向遷移存在作用［8］。作為CCL20的唯一配體CCR6，主要表達于Th17上，而且CCR6的表達與IL－17的產(chǎn)生呈正相關［9］，相關研究提示趨化因子CCL20是通過與其唯一配體CCR6結(jié)合形成CCL20/CCR6軸而對靶細胞產(chǎn)生特異的趨化作用［10］。已有研究表明他汀類藥物具有一定的抗炎作用，可以有效抑制炎癥細胞的遷移浸潤，Tae－Gyun等［11］通過體外培養(yǎng)HaTa細胞，在TNF－α、IL－17A的刺激下CCL20的表達顯著增高，而給予氟伐他汀或辛伐他汀后，CCL20的表達顯著下降，通過抑制CCL20/CCR6軸的作用從而下調(diào)了CD4+T細胞的遷移。多項研究表明，趨化因子通過免疫細胞異常遷徙介導自身免疫性疾病，而CCL20/CCR6軸可以通過趨化Th17細胞等免疫細胞參與銀屑病的發(fā)病。本研究選取由咪喹莫特誘導形成的小鼠銀屑病模型，同時選用CCL20單抗作為陽性藥，比較治療8 d后中藥組以及陽性藥物組小鼠與模型組小鼠皮損變化，研究涼血解毒湯是否通過對CCL20/CCR6軸產(chǎn)生影響從而對銀屑病發(fā)病機制進行干預。

肉眼觀察以及PASI評分結(jié)果顯示，模型組小鼠皮損增厚顯著，中藥治療組以及陽性藥物組小鼠皮損相比較有所減輕，提示由咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠在給予陽性藥CCL20抗體以及中藥治療8 d后可以顯著改善銀屑病樣皮損。組織學染色結(jié)果顯示模型組小鼠表皮層顯著增厚，皮下大量淋巴細胞浸潤，而中藥治療組以及陽性藥物組小鼠皮膚表皮層厚度較模型組薄，皮下淋巴細胞浸潤較輕，與肉眼大體觀察結(jié)果一致。通過對小鼠銀屑病皮損的CCL20/CCR6 mRNA表達進行檢測，模型組皮損CCL20mRNA的表達較空白組增多，而CCL20單抗治療組與LXJD治療組比較模型組顯著降低，而空白組與中藥治療組以及陽性藥組相比較差異不顯著，這一點與小鼠背部皮損的肉眼觀測結(jié)果以及組織學比較相吻合，提示陽性藥可以通過作用于表皮結(jié)合CCL20趨化因子從而減輕了銀屑病樣皮損，而中藥治療組小鼠皮損處CCL20 mRNA的表達也有所降低，由此可認為涼血解毒湯可以通過作用于CCL20趨化因子從而干擾了銀屑病發(fā)病機制。而模型組皮損CCR6 mRNA相比較空白組增高不明顯，但陽性藥組以及中藥治療組CCR6 mRNA的表達與模型組比較顯著降低，陽性藥組與中藥治療組比較，結(jié)果差異不顯著。而陽性藥組和中藥治療組與空白組比較，CCR6 mRNA表達有所降低，但是降低程度不具有統(tǒng)計學意義。提示小鼠正常皮膚中也有CCL20、CCR6 mRNA表達，而銀屑病樣皮損中CCL20和CCR6 mRNA的表達上調(diào)，在給予陽性藥治療后小鼠銀屑病樣皮損減輕，而皮損中CCL20和CCR6的mRNA表達顯著降低，中藥治療組與陽性藥組結(jié)果一致，差異不顯著，雖然對比空白組，模型組皮損CCR6 mRNA的表達增高不明顯，原因尚有待進一步的研究。已有研究表明CCL20/CCR6軸參與了銀屑病發(fā)病過程，而本研究可以肯定涼血解毒湯是通過作用于CCL20/CCR6軸從而減輕銀屑病皮損，對銀屑病發(fā)病環(huán)節(jié)進行干預。此項研究為臨床使用涼血解毒方治療銀屑病提供一定的理論依據(jù)，而在今后治療銀屑病過程中其干預銀屑病的作用靶點及思路仍是我們今后繼續(xù)研究的方向及重點。

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Effects of LXJD prescription，a Chinese medicine，on CCL20 and CCR6 expression in mouse skin with psoriasis

WANG Ying1，2，DI Ting－ting2，RUAN Zhi－tong1，2，ZHAO Jing－xia2，LI Ping1，2

(1Beijing Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University，2Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100010，China.E-mail:liping411@yahoo.com.cn)

AIM:To observe the effects of Liangxue－Jiedu(LXJD)prescription，a Chinese medicine，on the expression of CC chemokine ligand 20(CCL20)and CC chemokine receptor 6(CCR6)in imiquimod－induced psoriasislike skin lesions in a mouse model.METHODS:Male BALB/c mice were randomly divided into control group，model group，LXJD treatment group and chemokine CCL20 monoclonal antibody treatment group.The mouse model of psoriasis was induced by imiquimod.The severity of psoriasis was assessed by the dermatologists using psoriasis area and severity index(PASI).The morphological changes of the skin tissues were observed under light microscope.The thickness of epidermis was measured.Real－time PCR was used to detect the expression of CCL20 and CCR6 in the skin tissue samples.RESULTS:The skin in model group showed a large number of scales，erythema and skin thickening.Compared with model group，the skin lesion in LXJD treatment group was attenuated.The erythema and scales were alleviated，the PASI score was reduced，and the expression of CCL20 and CCR6 was significantly lower than that in model group.CONCLUSION:LXJD prescription down－regulates the expression of CCL20/CCR6，thus attenuating the psoriasis skin lesions in mice.

Psoriasis;CC chemokine ligand 20;CC chemokine receptor 6;Liangxue－Jiedu prescription

R758.63;R28

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.025

1000－4718(2015)02－331－06

2014－09－12

2014－10－27

國家自然科學基金資助項目(No.81302985)

△通訊作者Tel:010－52176679;E－mail:liping411@yahoo.com.cn