顏偉，許芳根，劉安文△，蔡婧，王碩

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院1腫瘤科，2消化內(nèi)科，江西 南昌 330006)

TLR4通過NF-κB信號(hào)途徑對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

顏偉1，許芳根2，劉安文1△，蔡婧1，王碩1

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院1腫瘤科，2消化內(nèi)科，江西 南昌 330006)

目的:研究Toll樣受體4(Toll－like receptor 4，TLR4)小干擾RNA(siRNA)是否通過NF－κB信號(hào)途徑下調(diào)Bcl－2而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。方法:設(shè)計(jì)并合成針對(duì)TLR4基因的3條特異性siRNA)及陰性siRNA，并同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，然后用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過半定量RT－PCR和Western印跡法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HeLa細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，Western印跡法檢測(cè)p65及Bcl－2蛋白表達(dá)水平，MTT法和平板克隆檢測(cè)細(xì)胞增殖率，Annexin V－FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果:3條針對(duì)TLR4基因的siRNA均能抑制TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)，其中TLR4－siRNA－003的沉默效率最高。轉(zhuǎn)染TLR4－siRNA－003 48 h后細(xì)胞中TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)62%和89%，p65及Bcl－2蛋白水平明顯下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞周期被阻滯于G1期。結(jié)論:TLR4特異性siRNA能夠有效沉默TLR4基因表達(dá)，并通過NF－κB信號(hào)通路下調(diào)Bcl－2而顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。TLR4可能成為治療宮頸癌的一個(gè)新靶點(diǎn)。

宮頸癌;Toll樣受體4;小干擾RNA;NF－κB信號(hào)通路;細(xì)胞增殖

宮頸癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，我國(guó)宮頸癌的發(fā)生率位居世界第一，占世界每年新增病例的28.8%，居女性生殖道惡性腫瘤第1位［1］。宮頸癌由于對(duì)大多數(shù)抗癌藥物不敏感，所以首選治療為手術(shù)及放射治療，但是晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者效果欠佳，化療具有全身作用特點(diǎn)，所以尋求新的靶位基因治療晚期宮頸癌成為研究的重點(diǎn)。Toll樣受體(Toll－like receptors，TLRs)屬于病原相關(guān)分子模式識(shí)別受體，在天然免疫及其繼發(fā)的獲得性免疫中起重要作用。近年研究［2］表明，TLRs在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，并具有配體特異性，通過配體的激活釋放腫瘤生長(zhǎng)因子和細(xì)胞生長(zhǎng)因子形成腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，逃避腫瘤免疫反應(yīng)。而TLRs中TLR4不但識(shí)別外源的病原體，還可識(shí)別內(nèi)源性物質(zhì)及其降解產(chǎn)物［3］。其激活的TRAF6可以結(jié)合ECSIT，激活MAPK途徑，活化NF－κB和低氧誘導(dǎo)因子－1α(hypoxia－inducible factor－1α，HIF－1α)信號(hào)［4］。Hasimu等［5］研究證實(shí)，TLR4在宮頸癌中表達(dá)異常，隨著宮頸病變程度升級(jí)而增高，蛋白表達(dá)升高，提示TLR4與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展可能有關(guān)。曾治民等［6］發(fā)現(xiàn)，采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默TLR4基因在肝癌細(xì)胞株Hep3B中的表達(dá)，可致細(xì)胞周期停滯于G2/M期，從而抑制癌細(xì)胞的異常增殖并促進(jìn)凋亡。但TLR4基因是否在宮頸癌細(xì)胞的異常增殖中起關(guān)鍵作用，目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以TLR4為靶基因，探討沉默TLR4后對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，并研究是否通過NF－κB信號(hào)途徑下調(diào)Bcl－2表達(dá)導(dǎo)致這種變化。

材料和方法

1 材料和試劑

人宮頸癌HeLa細(xì)胞由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子中心實(shí)驗(yàn)室保存;RPMI－1640培養(yǎng)液、胰酶及胎牛血清購(gòu)自Gibco;Trizol及LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海超研生物科技有限公司;TLR4多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz;NF－κB及Bcl－2多克隆抗體均購(gòu)自CST;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma;姬姆薩染液購(gòu)自上海博光生物科技有限公司;以TLR4基因?yàn)榘袠?biāo)的特異性siRNA和陰性對(duì)照siRNA均由廣州市銳博生物科技有限公司合成及純化。

2 TLR4 siRNAs的設(shè)計(jì)

通過Ambion網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)針對(duì)TLR4基因的3條特異性siRNA序列:TLR4－siRNA－001的正義鏈為5’－CAAUUCUGUUGCUUGUAUATT－3’，反義鏈為3’－TTGUUAAGACAACGAACAUAU－5’;TLR4－siRNA－002的正義鏈為5’－CAAUCUGACGAACCUAGUATT－3’，反義鏈為3’－TTGUUAGACUGCUUGGAUCAU－5’; TLR4－siRNA－003的正義鏈為5’－UUCGAGACUGGACAAGCCATT－3’，反義鏈為5’－UGGCUUGUCCAGUCUCGAATT－3’。同時(shí)，隨機(jī)設(shè)計(jì)FAM標(biāo)記、作為陰性對(duì)照的siRNA(negative siRNA)，正義鏈為5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’，反義鏈為5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’。

3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將宮頸癌HeLa細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至50%～70%融合度時(shí)，參考LipofectamineTM2 000說明書，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染各種siRNA(50 nmol/L)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照(control)組、陰性siRNA(negative siRNA)組和TLR4－siRNAs(包括TLR4－siRNA－001、002、003)組。

4 主要實(shí)驗(yàn)方法

4.1 半定量RT－PCRsiRNA轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TLR4引物的正義鏈為5’－ACCTGTCCCTGAACCCTATGAA－3’，反義鏈為5’－CTTCTAAACCAGCCAGACCTTG－3’;內(nèi)參照GAPDH引物的正義鏈為5’－GTTGGAGGTCGGAGTCAACGGA－3’，反義鏈為5’－GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA－3’。反應(yīng)條件為94℃5 min;然后94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，共33個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增片段大小分別為138 bp和240 bp。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，拍照并于凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，計(jì)算TLR4 mRNA與GAPDH mRNA的比值。

4.2 Western印跡法檢測(cè)TLR4、NF－κB及Bcl－2蛋白的表達(dá)siRNA轉(zhuǎn)染8 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白40 μg上樣，進(jìn)行10%的SDS－PAGE，濃縮膠80 V、分離膠120 V恒壓電泳，260 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。然后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入兔抗人TLR4或GAPDH抗體于4℃孵育過夜，次日TBST洗膜10 min 3次后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(稀釋比例為1∶5 000)于室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次。最后，ECL發(fā)光顯色，X膠片曝光，采集圖像，采用Image－Pro Plus軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參照。

4.3 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線收集轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸，以每孔5×103個(gè)接種于96孔板，每孔200 μL，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)活性(以490 nm波長(zhǎng)處的吸光度A值表示)，待測(cè)孔加入20 μL MTT，4 h后每孔加入150 μL DMSO，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，以MTT比色值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制出各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

4.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況收集轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸，以每孔2 000個(gè)接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)于37℃培養(yǎng)箱，每隔3 d換1次培養(yǎng)液。12 d后終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞，多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，并用姬姆薩染液20 min后，顯微鏡下計(jì)數(shù)含克隆形成數(shù)［克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%］。

4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期用0.25%不含EDTA胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染36 h后的細(xì)胞，離心，Annexin V－FITC/PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

用0.25%胰蛋白酶收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入1 mL 70%乙醇溶液，固定過夜。次日重懸細(xì)胞于500 μL PBS，加入2 g/L碘化丙啶(propidium iodide，PI)后，避光孵育30 min，然后使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，隨機(jī)取10個(gè)低倍視野，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)92.00%±4.67%，圖1顯示綠色熒光蛋白表達(dá)的情況。

Figure 1.Observation of cervical cancer HeLa cells transfected with siRNA by LipofectamineTM2000 under fluorescence microscope(×100).圖1 宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000法轉(zhuǎn)染后的熒光分布

2 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞TLR4基因表達(dá)水平的影響

通過半定量RT－PCR和Western印跡法分別檢測(cè)TLR4－siRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h后TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示3組TLR4－siRNA都能有效沉默TLR4的表達(dá)(P＜0.05)，其中轉(zhuǎn)染TLR4－siRNA－003組，TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)了62%和89%，下降最為顯著;而轉(zhuǎn)染negative siRNA組，TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯變化，見圖2。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇TLR4－siRNA－003進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。

3 TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞NF-κB及Bcl-2表達(dá)水平的影響

選擇沉默效率最高的TLR4－siRNA－003進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后，通過Western印跡法分別檢測(cè)p65及Bcl－2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TLR4－siRNA－003組的HeLa細(xì)胞中p65及Bcl－2的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染negative siRNA組的HeLa細(xì)胞中p65及Bcl－2的蛋白表達(dá)水平基本無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

4 TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響

選擇沉默效率最高的TLR4－siRNA－003進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，分別通過MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，重新種板24 h后，TLR4－siRNA－003組的HeLa細(xì)胞增殖開始受到明顯抑制，在24、48和72 h這3個(gè)時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率分別為(19.17±2.12)%、(38.75± 2.87)%和(51.50±3.32)%，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染negative siRNA組對(duì)HeLa細(xì)胞增殖無明顯影響(圖4A)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT檢測(cè)結(jié)果相同，control、negativesiRNA和TLR4－siRNA－003各組克隆形成率依次為(80.56±8.53)%、(78.87±9.78)%和(18.89± 4.13)%，與空白對(duì)照組和陰性siRNA組相比，轉(zhuǎn)染TLR4－siRNA－003后HeLa細(xì)胞的克隆集落數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染negative siRNA組對(duì)HeLa細(xì)胞克隆形成能力無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。

Figure 2.Effects of TLR4 siRNA transfection on the expression of TLR4 at mRNA(A)and protein(B)levels in the cervical cancer HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control or negative siRNA.圖2 TLR4基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The protein expression of p65 and Bcl－2 in the HeLa cells after silencing TLR4 gene.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control or negative siRNA.圖3 沉默TLR4后HeLa細(xì)胞中p65和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平

5 TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V－FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組及陰性siRNA組中宮頸癌細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染TLR4－siRNA－003組，宮頸癌細(xì)胞凋亡率為39.21%，與正常組及陰性siRNA組相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5，提示TLR4－siRNA轉(zhuǎn)染能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

6 TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與陰性siRNA組中宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染TLR4－siRNA－003后G0/G1期HeLa細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.05)，見圖6，提示TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染能夠阻滯細(xì)胞周期在G0/ G1期。

Figure 4.The growth rate of cervical cancer HeLa cells transfected with TLR4siRNA analyzed by MTT assay(A)and colony formation assay(B).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control or negative siRNA.圖4 MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活性的影響

Figure 5.The apoptotic rate of cervical cancer HeLa cells transfected with TLR4 siRNA detected by flow cytometry with Annexin VFITC/PI staining.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control or negative siRNA.圖5 Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響

討論

天然免疫的重要模式識(shí)別受體Toll樣受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是連接固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁。TLRs不僅普遍表達(dá)于巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，介導(dǎo)各種致病病原體引起的宿主免疫防衛(wèi)反應(yīng)，也表達(dá)于結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、黑色素瘤及肺癌等多種腫瘤細(xì)胞，并人白細(xì)胞介素1受體的胞內(nèi)區(qū)高度同源。其作為先天免疫的重要組分在一些無明顯病原體感染的慢性炎在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7－8］。

TLR4是TLRs受體家族重要成員之一，屬于I型跨膜受體，胞外域富含亮氨酸的重復(fù)序列，能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，胞內(nèi)區(qū)由Toll同源結(jié)構(gòu)域和分子羧基端長(zhǎng)短不同的短尾肽(1～22個(gè)氨基酸)組成，與癥性疾病及炎癥相關(guān)腫瘤中的作用是目前研究的熱點(diǎn)。

NF－κB是屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子。它是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，廣泛存在于多種細(xì)胞中，激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生理病理過程中發(fā)揮作用［9］。NF－κB家族由5個(gè)蛋白組成，包括c－Rel、RelB、RelA/p65、NF－κB(p50和p105)和NF－κB2［10－11］。大量的實(shí)驗(yàn)證明，許多因素可以引起NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，目前公認(rèn)的主要包括經(jīng)典途徑及旁路途經(jīng)［12－13］。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的p50/p65與IκB結(jié)合成3聚體，使p50/p65不能核易位，在經(jīng)典途徑中，當(dāng)細(xì)胞受到如細(xì)胞因子、有絲分裂原、內(nèi)毒素、病毒蛋白、過氧化物、蛋白激酶C、鈣離子載體、蛋白合成抑制劑及X射線等細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，IKK的IKKβ亞單位被磷酸化激活，繼而引起IκBα的Ser32和Ser36位點(diǎn)被磷酸化。磷酸化的IκBα再被泛素化后在26S蛋白水解酶復(fù)合體作用下降解，而被釋放的p50/p65則進(jìn)行核易位，與基因上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用［14］。目前的許多研究提示NF－κB的激活對(duì)細(xì)胞的生存具有重要意義。NF－κB抗細(xì)胞凋亡是一個(gè)涉及多個(gè)信號(hào)通路的復(fù)雜過程，但其主要方式是通過誘導(dǎo)或上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，這些基因調(diào)節(jié)位點(diǎn)上有NF－κB的結(jié)合位點(diǎn)，它們的表達(dá)產(chǎn)物通過抑制細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑或線粒體途徑發(fā)揮作用。到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)、Bcl－2家族、TRAF1、TRAF－2、JNK、c－FLIP、IEX－IL等都參與NF－κB激活后的抗細(xì)胞凋亡過程［15］。

Bcl－2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì)［16］。在線粒體上，Bcl－2家族蛋白通過與其它凋亡蛋白的協(xié)同作用，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡“主開關(guān)”的作用。許多研究結(jié)果均表明，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著“主開關(guān)”作用，而Bcl－2家族蛋白的主要作用位點(diǎn)就在線粒體膜上［17－18］。Bcl－2和Bcl－xL是Bcl－2家族蛋白成員中主要的抗凋亡分子，Bcl－2和Bcl－xL通過其BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl－2家族的促凋亡蛋白形成異二聚體，從而維持促凋亡成員在細(xì)胞內(nèi)的定位分布，保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序［19］。

Figure 6.Cell cycle distribution of cervical cancer HeLa cells transfected with TLR4 siRNA analyzed by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control or negative siRNA.圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞周期分布的影響

王永軍等［20］研究發(fā)現(xiàn)，TLR4的表達(dá)隨著宮頸病變程度的升級(jí)而升高。Cheng等［21］研究證實(shí)TLR4在宮頸癌中是高表達(dá)的，由HPV脂多糖(LPS)激活的TLR4信號(hào)有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用，而且TLR4信號(hào)還能通過激活NF－κB信號(hào)通路來促進(jìn)免疫抑制因子IL－6和TGF－β1的分泌，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展。推測(cè)其可能機(jī)制為TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合后激活多個(gè)下游分子(如NF－κB、AP－1、IRF家族、P38等調(diào)節(jié)因子)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生和進(jìn)展［22］，因此，推測(cè)TLR4可作為宮頸癌復(fù)發(fā)、化療耐藥和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，若有效下調(diào)TLR4基因在宮頸癌細(xì)胞中的過度表達(dá)，控制癌細(xì)胞的過度增殖，可能對(duì)治療宮頸癌具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選擇宮頸癌HeLa細(xì)胞株，設(shè)計(jì)針對(duì)TLR4基因中3個(gè)干擾靶點(diǎn)的siRNA，轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株后，探討運(yùn)用RNA干擾技術(shù)沉默TLR4基因的可行性及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，并探討是否通過NF－κB信號(hào)通路下調(diào)Bcl－2導(dǎo)致這種結(jié)果。結(jié)果表明，宮頸癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后，3條TLR4 siRNA中以TLR4－siRNA－003對(duì)TLR4基因的沉默效率最顯著，其相對(duì)于空白對(duì)照組，TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)62%和89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默TLR4基因表達(dá)后，p65及Bcl－2蛋白表達(dá)水平顯著下降，HeLa細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期。

綜上所述，本研究成功設(shè)計(jì)了針對(duì)TLR4基因的siRNA，并證實(shí)了TLR4 siRNA能夠特異性沉默TLR4基因在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，通過抑制NF－κB信號(hào)通路的激活，下調(diào)p65的表達(dá)，從而抑制Bcl－2表達(dá)，并有效抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及克隆增殖能力。上述結(jié)果提示TLR4可作為預(yù)測(cè)宮頸癌細(xì)胞增殖的一個(gè)新指標(biāo)，也有望成為應(yīng)用于宮頸癌基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

［1］章文華.子宮頸癌防治展望［J］.癌癥進(jìn)展，2010，8 (2):105－108.

［2］Huang B，Zhao J，Li H，et al.Toll－like receptors on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance［J］.Cancer Res，2005，65(12):5009－5014.

［3］Challa S，Woelfel M，Guildford M，et al.Viral cell death inhibitor MC159 enhances innate immunity against vaccinia virus infection［J］.J Virol，2010，84(20):10467－10476.

［4］Ramanathan M，Luo W，Csóka B，et al.Differential regulation of HIF－1α isoforms in murine macrophages by TLR4 and adenosine A2Areceptor agonists［J］.J Leukocyte Biol，2009，86(3):681－689.

［5］Hasimu A，Ge L，Li QZ，et al.Expressions of Toll－like receptors 3，4，7，and 9 in cervical lesions and their correlation with HPV16 infection in Uighur women［J］.Chin J Cancer，2011，30(5):344－350.

［6］曾治民.Toll樣受體4的表達(dá)及miR－TLR4干擾對(duì)HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)活性影響［D］.南昌:南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2013.

［7］Chen R，Alvero AB，Silasi DA，et al.Cancers take their Toll:the function and regulation of Toll－like receptors in cancer cells［J］.Oncogene，2008，27(2):225－233.

［8］Chen K，Huang J，Gong W，et al.Toll－like receptors in inflammation，infection and cancer［J］.Int Immunopharmacol，2007，7(10):1271－1285.

［9］Barnes PJ，Karin M.Nuclear factor－κB:a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases［J］.N Engl J Med，1997，336(15):1066－1071.

［10］Ostuni R，Zanoni I，Granucci F.Deciphering the complexity of Toll－like receptor signaling［J］.Cell Mol Life Sci，2010，67(24):4109－4134.

［11］Yang J，Amiri KI，Burke JR，et al.BMS－345541 targets inhibitor of κB kinase and induces apoptosis in melanoma: involvement of nuclear factor κB and mitochondria pathways［J］.Clin Cancer Res，2006，12(3 Pt 1):950－960.

［12］Bonizzi G，Karin M.The two NF－κB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity［J］.Trends Immunol，2004，25(6):280－288.

［13］Luo JL，Kamata H，Karin M.IKK/NF－κB signaling:balancing life and death－a new approach to cancer therapy［J］.J Clin Invest，2005，115(10):2625－2632.

［14］Li ZW，Chu W，Hu Y，et al.The IKKβ subunit of IκB kinase(IKK)is essential for nuclear factor κB activation and prevention of apoptosis［J］.J Exp Med，1999，189 (11):1839－1845.

［15］Kucharczak J，Simmons MJ，F(xiàn)an Y，et al.To be，or not to be:NF－κB is the answer－role of Rel/NF－κB in the regulation of apoptosis［J］.Oncogene，2003，22(56): 8961－8982.

［16］季紅斌，翟琦巍，劉新垣.bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2000，32(2):95－99.

［17］樊廷俊，夏蘭，韓貽仁.線粒體與細(xì)胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2001，33(1):7－12.

［18］林其誰.線粒體與細(xì)胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1999，31(2):116－118.

［19］Degterev A，Lugovskoy A，Cardone M，et al，Identification of small－molecule inhibitors of interaction between the BH3 domain and Bcl－xL［J］.Nat Cell Biol，2001，3(2): 173－182.

［20］王永軍，翁艷潔，石英，等.TLR4在宮頸癌與不同HPV亞型宮頸癌細(xì)胞株中表達(dá)及意義［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2012，8(5):419－423.

［21］Cheng YX，Qi XY，Huang JL，et al.Toll－like receptor 4 signaling promotes the immunosuppressive cytokine production of human cervical cancer［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2012，33(3):291－294.

［22］He W，Liu Q，Wang L，et al.TLR4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance［J］.Mol Immunol，2007，44(11):2850－2859.

Effect of Toll like-receptor 4 on proliferation of cervical cancer cells by NF-κB signaling pathway

YAN Wei1，XU Fang－gen2，LIU An－wen1，CAI Jing1，WANG Shuo1

(1Department of Oncology，2Department of Digestive Medicine，The Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.E-mail:awliu666@163.comwhether)

AIM:To investigate whether specific small interfering RNA(siRNA)targeting Toll－like receptor 4 (TLR4)gene inhibits the proliferation of cervical cancer cell line HeLa through NF－κB signaling pathway and down－regulation of Bcl－2 expression.METHODS:Three specific TLR4 siRNAs and 1 negative siRNA were transfected respectively into HeLa cells.The expression of TLR4 at mRNA and protein levels was measured by reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)and Western blotting，respectively.The protein expression of p65 and Bcl－2 was detected by Western blotting.The cell proliferation was determined by MTT assay and plate colony formation assay.The apoptotic rate of the cells and the cell cycle were analyzed by flow cytometry.RESULTS:In comparison with the other 2 kinds of TLR4 siRNAs，TLR4－siRNA－003 demonstrated the strongest silencing effect on TLR4 gene expression in the HeLa cells at 48 h after transfection.The expression of TLR4 at mRNA and protein levels was reduced by 62%and 89%，respectively.The protein levels of p65 and Bcl－2 significantly decreased.The growth rate of HeLa cells transfected with TLR4－siRNA－003 was significantly inhibited.Moreover，the cell apoptotic rate increased significantly and the cell cycle was arrested at G1phase as the HeLa cells were transfected with TLR4－siRNA－003 for 48 h.CONCLUSION:Specific TLR4 siRNA effectively inhibits the expression of TLR4 and inhibits the proliferation of cervical cancer HeLa cells through NF－κB signaling pathway and down－regulation of Bcl－2 expression，indicating that TLR4 may be a new target for the treatment of cervical cancer.

Cervical cancer;Toll－like receptor 4;Small interfering RNA;NF－κB signaling pathway;Cell proliferation

R737.33;R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.020

1000－4718(2015)02－301－07

2014－09－30

2014－11－26

△通訊作者Tel:0791－86273751;E－mail:awliu666@163.com