朱棟良，尹小平，王芳元

(咸寧市中心醫(yī)院，同濟咸寧醫(yī)院肝膽胰胃腸外科，湖北 咸寧 437100)

長鏈非編碼RNA母系表達基因3對結(jié)直腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響

朱棟良，尹小平，王芳元△

(咸寧市中心醫(yī)院，同濟咸寧醫(yī)院肝膽胰胃腸外科，湖北 咸寧 437100)

目的:檢測長鏈非編碼RNA母系表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)在結(jié)直腸癌細胞中的表達，并觀察過表達MEG3對結(jié)直腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響。方法:檢測人正常結(jié)腸細胞NCM460及結(jié)直腸癌細胞SW48、LoVo中MEG3的水平，在SW48細胞和LoVo細胞中轉(zhuǎn)染MEG3過表達質(zhì)粒，利用Transwell小室及劃痕實驗觀察過表達MEG3對細胞侵襲和遷移能力的影響，通過Western blotting檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果:結(jié)直腸癌細胞SW48和LoVo中MEG3的水平明顯低于人正常結(jié)腸細胞NCM460;在SW48和LoVo細胞中過表達MEG3后能夠明顯抑制細胞的侵襲和遷移能力;Transwell侵襲實驗和遷移實驗顯示MEG3表達組SW48細胞的穿膜數(shù)及LoVo細胞的穿膜數(shù)與對照組比較明顯減少。劃痕實驗中過表達MEG3后細胞間距較對照組明顯增大，提示細胞運動能力減弱。同時過表達MEG3可明顯降低細胞中MMP－2及MMP－9的表達，增高金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase－2，TIMP－2)的表達。結(jié)論:結(jié)直腸癌細胞中MEG3水平較正常結(jié)直腸細胞明顯降低;在結(jié)直腸癌中過表達MEG3可抑制細胞的侵襲、遷移運動能力，并且可能通過影響TIMP－2、MMP－2及MMP－9的表達發(fā)揮上述功能。

長鏈非編碼RNA;母系表達基因3;結(jié)直腸腫瘤;腫瘤侵襲;細胞遷移;基質(zhì)金屬蛋白酶

長鏈非編碼RNA(long non－coding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于人類基因組中，根據(jù)目前的人類全基因組測序的結(jié)果推斷，大概有20～40萬種不同的lncRNA，數(shù)量約為編碼基因的10～20倍。lncRNA可通過不同方式影響編碼基因的表達量和功能，對細胞的生物學(xué)進程起調(diào)控作用［1－2］。母系表達基因3 (maternally expressed gene 3，MEG3)是目前發(fā)現(xiàn)lncRNA中的一個，其主要表達于正常大腦、骨髓、乳腺、子宮、肺及胃腸道組織中，而在多種惡性腫瘤中表達明顯減低乃至缺失［3－5］。既往文獻報道MEG3的表達抑制可能在胃癌的增殖中發(fā)揮重要的作用［6］，但MEG3在結(jié)腸癌中有何作用尚不明確。本研究擬利用人正常結(jié)腸細胞NCM460及人結(jié)直腸癌細胞SW48、LoVo觀察MEG3對于結(jié)直腸癌細胞侵襲遷移的影響，并初步探索其中可能的機制。

材料和方法

1 細胞及試劑

人正常結(jié)腸細胞系NCM460及人結(jié)直腸癌細胞系SW48、LoVo購自中科院上海細胞庫;抗MMP－2抗體、抗MMP－9抗體、抗TIMP－2抗體及抗GAPDH抗體(Cell Signalling);Transwell(8 μm孔徑)及Matrigel等均購自武漢博士德生物有限公司;PCR引物由廣州銳博生物有限公司設(shè)計并合成，其中MEG3的上游引物為5’－GGAGCTGTTGAGCCTTCAGT－3’，下游引物為5’－ATTGAGAGCACAGTGGGGTG－3’;U6的上游引物為5’－GACAGACCCTCACTACTG－3’，下游引物為5’－GATAGTACATGACAAGCTGC－3’;MEG3過表達質(zhì)粒由武漢擎科生物有限公司設(shè)計并合成。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)NCM460、SW48及LoVo 3種細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2溫箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2.2 實時熒光定量PCR(real－time PCR)檢測NCM460、SW48及LoVo中MEG3的表達收集1× 106細胞，通過Trizol一步法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用上述引物行PCR擴增，ABI 7300檢測并分析各細胞中MEG3的水平。

2.3 Transwell侵襲實驗利用脂質(zhì)體對SW48細胞及LoVo細胞常規(guī)轉(zhuǎn)染MEG3過表達質(zhì)粒，使其中的MEG3高表達，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為陰性對照。收集轉(zhuǎn)染后的各組細胞，重懸于無血清RPMI－1640培養(yǎng)液，以每孔5×104加入到預(yù)鋪好Matrigel的Transwell小室上室內(nèi)，下室加入500 mL完全培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后多聚甲醛固定，0.01%結(jié)晶紫染色，200倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)，隨即取5個視野，取平均值，每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.4 Transwell遷移實驗利用上述轉(zhuǎn)染后收集的各組細胞，重懸于無血清RPMI－1640培養(yǎng)液，以每孔5×104加入到Transwell小室上室內(nèi)，下室加入500 mL完全培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后多聚甲醛固定，0.01%結(jié)晶紫染色，200倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)，隨即取5個視野，取平均值，每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。2.5細胞劃痕運動實驗將SW48細胞及LoVo細胞按照每孔5×105接種于6孔板中，按照上述實驗分組轉(zhuǎn)染48 h后，細胞融合度達到95%以上，用無菌Tip頭部劃線，置于37°C、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后光學(xué)顯微鏡下拍照，隨即取5個視野，測量劃痕兩側(cè)細胞間距取平均值，每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.6 免疫印跡(Western blotting)實驗收集上述轉(zhuǎn)染后的各組細胞，裂解獲取細胞總蛋白，各樣品通過BCA法檢測蛋白濃度，各蛋白樣品按照上述檢測所得濃度分別取50 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后依次孵育I抗及II抗最后用ECL顯色液顯影檢測細胞中MMP－2、MMP－9及TIMP－2的表達，以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果通過ImageJ進行灰度值分析并通過統(tǒng)計學(xué)檢驗，實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 MEG3在結(jié)直腸癌細胞中表達明顯減少

通過real－time PCR檢測NCM460、SW48及LoVo細胞中MEG3的表達，利用U6作為內(nèi)參照，結(jié)果提示相對于正常結(jié)腸細胞NCM460，結(jié)直腸癌細胞SW48細胞及LoVo細胞中MEG3的水平明顯降低，而通過外源性轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)?？梢悦黠@恢復(fù)細胞中MEG3的水平，見圖1。

2 過表達MEG3抑制結(jié)直腸癌細胞侵襲

按上述分組將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于預(yù)鋪Matri gel的Transwell小室中檢測其侵襲能力。結(jié)果提示高表達MEG3的SW48細胞其穿膜細胞數(shù)為(33± 7)個/視野，相比對照組［(228±11)個/視野)］顯著減少(P＜0.05);高表達MEG3的LoVo細胞其穿膜細胞數(shù)為(28±5)個/視野，相比對照組［(198± 17)/視野)］顯著減少(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.The expression of MEG3 was detected in colorectal cancer cells，and MEG3 was over－expressed by plasmid transfection.A: the expression of MEG3 in NCM460，SW48 and LoVo cells;B，C:MEG3 was over－expressed by plasmid transfection in SW48 and LoVo cells，respectively.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCM460 or control.圖1 檢測MEG3在結(jié)腸癌細胞中的表達水平并通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達MEG3

Figure 2.Over－expression of MEG3 inhibited the invasion of colorectal cancer cells observed by Transwell assay with Matrigel(×400).圖2 過表達MEG3抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲能力

3 過表達MEG3抑制結(jié)直腸癌細胞遷移

按上述分組將轉(zhuǎn)染后的細胞直接接種于Transwell小室中檢測其遷移能力，結(jié)果提示，高表達MEG3的SW48細胞其穿膜細胞數(shù)為(46±6)個/視野，相比于對照組［(341±16)個/視野］顯著減少(P＜0.05);高表達MEG3的LoVo細胞其穿膜細胞數(shù)為(39±3)個/視野，相比對照組［(263±10)個/視野)］顯著減少(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Over－expression of MEG3 inhibited the migration of colorectal cancer cells observed by Transwell assay (×400).圖3 過表達MEG3抑制結(jié)腸癌細胞的遷移能力

4 過表達MEG3抑制結(jié)直腸癌細胞運動

將SW48細胞及LoVo細胞分別接種于6孔板，轉(zhuǎn)染MEG3過表達質(zhì)粒后行細胞劃痕，24 h后普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果提示，SW48細胞及LoVo細胞高表達MEG3后，與對照相比，劃痕兩側(cè)細胞間距明顯增大，細胞的運動能力減弱，見圖4。

5 過表達MEG3抑制基質(zhì)金屬蛋白酶家族相關(guān)蛋白的表達

將上述細胞裂解提取總蛋白后行Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，高表達MEG3后MMP－2和MMP－9的表達明顯降低(P＜0.05)，而TIMP－2的表達增高(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.Over－expression of MEG3 inhibited the mobility of colorectal cancer cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖4 過表達MEG3抑制結(jié)腸癌細胞的運動能力

Figure 5.The effect of MEG3 on the expression of MMP family proteins in colorectal cancer cells detected by Western blotting.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖5 過表達MEG3對基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白表達的影響

討論

隨著人類基因組計劃的完成，人們發(fā)現(xiàn)基因組中除了大約20 000個蛋白編碼基因，還同時含有大量的非編碼RNAs(non－coding RNAs，ncRNAs)。ncRNAs本身雖不能編碼蛋白質(zhì)，但能通過多種方式調(diào)控編碼基因的表達和功能，近數(shù)10年來針對ncRNAs的研究多集中在microRNAs上，并取得了諸多研究成果［7－10］，但對于序列長度超過200核苷酸的lncRNAs的研究尚剛剛起步。lncRNAs的序列長度長于microRNAs，其調(diào)控基因表達和功能的方式也與microRNAs迥異，不僅可以影響蛋白翻譯發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，還可通過影響基因的轉(zhuǎn)錄活性及蛋白降解等多種途徑發(fā)揮功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，MEG3作為一種印跡基因編碼的lncRNA，在胚胎發(fā)育及多種正常細胞中均有明顯表達，但在垂體瘤、肝細胞癌、卵巢癌等多種腫瘤中表達明顯降低或缺失，而且MEG3的表達降低與胃癌的臨床預(yù)后不佳相關(guān)，MEG3還可以通過調(diào)控P53的表達影響非小細胞肺癌的增殖和凋亡［3－6］。但MEG3在結(jié)直腸癌細胞的表達及功能尚不十分明確。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，MEG3在結(jié)直腸癌細胞的表達明顯低于正常結(jié)腸細胞，提示MEG3的表達抑制可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生。結(jié)直腸癌細胞最重要的惡性行為即具有高度的侵襲轉(zhuǎn)移能力，所以我們進一步在結(jié)直腸癌細胞中通過轉(zhuǎn)染MEG3過表達質(zhì)粒恢復(fù)其表達，觀察過表達MEG3對于細胞侵襲遷移能力的影響。而Transwell侵襲、遷移實驗及細胞劃痕運動實驗均證實過表達MEG3可以明顯抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移能力，提示MEG3不僅參與結(jié)直腸癌的發(fā)生，更有可能與結(jié)直腸癌細胞的侵襲遷移相關(guān)。為了明確MEG3通過何種機制促進腫瘤細胞侵襲遷移能力，我們通過Western blotting檢測基質(zhì)金屬蛋白酶家族相關(guān)基因的表達?；|(zhì)金屬蛋白酶是目前公認的調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，不同類型的基質(zhì)金屬蛋白酶表達增高或者活性升高，抑或TIMP－2等基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物的下調(diào)都能促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)過表達MEG3可以顯著抑制MMP－2及MMP－9的表達，而上調(diào)TIMP－2的表達，從而為MEG3調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的侵襲遷移提供了可能的理論依據(jù)。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細胞中MEG3的表達明顯降低，在結(jié)直腸癌細胞中過表達MEG3可抑制細胞的侵襲、遷移及運動能力。同時過表達MEG3后基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白明顯變化，提示MEG3可能通過其調(diào)控結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。本文提示MEG3在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供了新的藥物靶點及監(jiān)測指標。

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Effect of long non-coding RNA MEG3 on invasion and migration of colorectal cancer cells

ZHU Dong－liang，YIN Xiao－ping，WANG Fang－yuan

(Department of General Surgery，Xianning Central Hospital，Tongji Xianning Hospital，Xianning 437100，China.E-mail: xnzxyywfy@126.com)

AIM:To investigate the expression of long non－coding RNA maternally expressed gene 3(MEG3) in colorectal cancer(CRC)cells，and to observe the effect of MEG3 on the invasion and migration of CRC cells.METHODS:The levels of MEG3 in human normal colon cell NCM460 and CRC cells SW48 and LoVo were detected by real－time PCR.MEG3 was over－expressed by plasmid transfection，and the effects of MEG3 on the invasion and migration of SW48 and LoVo cells were analyzed by Transwell assay and wound healing assay.The expression of matrix metalloproteinase (MMP)family proteins was determined by Western blotting.RESULTS:The level of MEG3 was down－regulated in CRC cells compared with normal colon cell NCM460.The invasion and migration of CRC cells were reduced after MEG3 over－expression.Transwell invasion and migration assays showed that the numbers of transmembrane SW48 and LoVo cells were smaller in MEG3 over－expression group than control group(P＜0.05).The cell spaces were broader after MEG3 over－expression in the wound healing assay，indicating that MEG3 over－expression inhibited the mobility of CRC cells.Meanwhile，over－expression of MEG3 reduced the expression of MMP－2 and MMP－9，and elevated the expression of tissue inhibitor of metalloproteinase－2(TIMP－2).CONCLUSION:The expression of MEG3 is down－regulated in CRC cells.Over－expression of MEG3 inhibits the invasion and migration of CRC cells.TIMP－2，MMP－2 and MMP－9 might play an important role in this regulation.

Long non－coding RNA;Maternally expressed gene 3;Colorectal neoplasms;Neoplasm invasiveness;Cell migration;Matrix metalloproteinase

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.019

1000－4718(2015)02－296－05

2014－09－17

2014－11－24

△通訊作者Tel:0715－8896278;E－mail:xnzxyywfy@126.com