李華波，陳世健，胡建華，汪蓮開

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 恩施 445000)

通心絡(luò)對(duì)心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43重構(gòu)及室性心律失常的影響*

李華波，陳世健，胡建華，汪蓮開△

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 恩施 445000)

目的:探討通心絡(luò)(TXL)對(duì)心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43(Cx43)重構(gòu)及室性心律失常(VA)的影響。方法:雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組(n=25)和手術(shù)組(n=75)。手術(shù)組動(dòng)物結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備心肌梗死模型，假手術(shù)組只開胸不結(jié)扎。將手術(shù)后存活3 d的大鼠隨機(jī)分為TXL治療組(TXL組)和心肌梗死組(MI組)。TXL組給予TXL(2 g·kg－1·d－1)連續(xù)4周灌胃治療，MI組和sham組則給予等體積生理鹽水灌胃。藥物干預(yù)結(jié)束后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)梗死周邊區(qū)心肌組織白細(xì)胞介素－1β(IL－1β)及內(nèi)皮素－1 (ET－1)的水平;免疫組化法檢測(cè)Cx43的分布;Western blotting法檢測(cè)Cx43表達(dá);RT－PCR法檢測(cè)Cx43 mRNA的表達(dá);采用Burst刺激誘發(fā)VA。結(jié)果:與sham組相比，MI組梗死周邊心肌的IL－1β和ET－1水平均顯著升高，而Cx43的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低，Cx43分布無規(guī)律性且側(cè)面化分布增多，VA誘發(fā)率也明顯升高(P＜0.05);與MI組相比，TXL組梗死周邊心肌IL－1β和ET－1水平明顯降低，Cx43的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增加，Cx43部分呈線性分布于心肌細(xì)胞閏盤處，VA誘發(fā)率也明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:TXL可降低心肌梗死大鼠VA的發(fā)生率，其機(jī)制可能與TXL抑制心肌梗死后Cx43重構(gòu)有關(guān)。

心肌梗死;通心絡(luò);縫隙連接蛋白43;室性心律失常

縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是一種溝通相鄰細(xì)胞胞質(zhì)的連接通道，它廣泛分布于心肌組織，為心肌細(xì)胞間提供了低電阻的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。一些研究結(jié)果顯示心肌梗死(myocardial infarction，MI)后存在Cx43重構(gòu)的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為梗死心肌Cx43表達(dá)下降及側(cè)面化分布增多［1－2］。這些研究還表明Cx43的這種重構(gòu)可能與心肌梗死后室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)及猝死的發(fā)生有關(guān)。通心絡(luò)(tongxinluo，TXL)是祖國醫(yī)學(xué)中依據(jù)絡(luò)病學(xué)理論研制而成的一種復(fù)方制劑，既往細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)TXL可抑制異丙腎上腺素引起的心肌細(xì)胞Cx43 mRNA表達(dá)下調(diào)［3］，由此提示我們，TXL可能具有改善心肌梗死后Cx43重構(gòu)的作用，從而降低心肌梗死后VA的發(fā)生率。本研究通過給予心肌梗死大鼠TXL干預(yù)，探討用TXL治療對(duì)大鼠心肌梗死后Cx43重構(gòu)及VA誘發(fā)率的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物分組、模型制備及藥物干預(yù)

實(shí)驗(yàn)用雄性SD大鼠100只，體重200～250 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)將動(dòng)物分為假手術(shù)(sham)組(n=25)和手術(shù)組(n=75)。手術(shù)組動(dòng)物給予3%苯巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，10 min后自左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎的方法制備心肌梗死模型。術(shù)中心電監(jiān)護(hù)，以心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段抬高和缺血區(qū)域心肌顏色改變作為造模成功的標(biāo)志。心肌梗死造模后存活3 d大鼠共64只，隨后被隨機(jī)分成TXL治療組(TXL組，n=32)和心肌梗死組(MI組，n =32)。假手術(shù)組動(dòng)物采用相同的開胸方法，但是只剪開心包腔，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。于造模后第4天，TXL組參照文獻(xiàn)［4］給予TXL(2 g·kg－1·d－1)灌胃治療連續(xù)4周，而MI組和sham組則給予等體積生理鹽水連續(xù)灌胃4周。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 心肌組織白細(xì)胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)及內(nèi)皮素－1(endothelin－1，ET－1)水平的檢測(cè)

每組各選4只動(dòng)物給予戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后處死，迅速取出心臟，取梗死周邊區(qū)左室心肌組織100 mg，加入0.6 mL生理鹽水，用組織勻漿機(jī)按10 000～15 000r/min上下研磨制成組織勻漿(勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30 s，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行)，迅速勻漿后，以14 000 r/min在4℃下離心10 min，取上清存放于－80℃冰箱待用。測(cè)定前用生理鹽水將上清液體積調(diào)為1 mL。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定心肌組織中的IL－1β及ET－1水平，ELISA試劑盒購自RD，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成。

2.2 RT－PCR檢測(cè)Cx43 mRNA的表達(dá)量每組各選4只動(dòng)物安樂死后迅速取出心臟，剪下梗死周邊區(qū)左心室組織100 mg，加入1 mL預(yù)冷的Trizol在冰上充分研磨提取總RNA。根據(jù)Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并置于－20oC冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肞rimer 5.0設(shè)計(jì)引物并由Invitrogen公司合成。上游引物序列為5’－TGAAAGAGAGGTGCCCAGA－3’，下游引物序列為5’－CGTGAGAGATGGGGAAGGACT－3’。

2.3 Western blotting檢測(cè)Cx43及磷酸化Cx43(p－Cx43)蛋白表達(dá)量每組各選4只動(dòng)物安樂死后迅速取出心臟，剪下梗死邊緣區(qū)左心室組織100 mg，將組織剪成細(xì)小的碎片，按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000×g離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于－80℃冰箱。利用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉中4℃過夜，分別加入1∶1 000稀釋的I抗(Cx43多克隆抗體和p－Cx43多克隆抗體)和1∶1500的β－actin抗體，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入1∶1 500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗(IgG)中室溫下孵育1 h，然后TBST洗膜3次。將膜與ECL反應(yīng)1～5 min后，曝光于感光膠片上，顯影、定影。

2.4 在體VA的誘發(fā)將各組剩下的動(dòng)物行在體電生理研究。以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg，Sigma)行腹腔注射麻醉，多導(dǎo)電生理記錄儀記錄大鼠的體表II導(dǎo)聯(lián)心電圖。將1對(duì)鉑金刺激電極(兩電極間距為1 mm)連接于LEAD2000B多道電生理儀(四川錦江通用實(shí)業(yè)有限公司)，動(dòng)物開胸后，將刺激電極置于右室流出道行Burst刺激(給予50 Hz持續(xù)時(shí)間2 s的Train刺激，總刺激時(shí)間小于2 min)誘發(fā)VA。VA持續(xù)時(shí)間超過2 s即記為VA可誘發(fā)，超過30 s即記為持續(xù)性室性心律失常(SVA)［5］。

2.5 免疫組化分析Cx43的分布在體電生理研究結(jié)束后，每組各選5個(gè)心臟行免疫組化分析Cx43的分布情況。取梗死周邊區(qū)心肌組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋切片，片厚4～5 μm，每個(gè)心臟做3張切片。組織切片加入I抗Cx43單克隆抗體(1∶200，Chemicon)后置于4°C濕盒中孵育過夜;第2天用PBS沖洗切片3次，每次2 min，吸水紙擦干切片后滴加熒光素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆IgG(1∶100，Zymed)，37℃孵育20～30 min。Cx43陽性的表達(dá)區(qū)域由Image－Pro Plus 4.0軟件及專用顯微鏡組成的計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行定量測(cè)定，其結(jié)果通過Cx43陽性表達(dá)區(qū)域在總面積中所占的比例表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 動(dòng)物的存活情況

Sham組25只大鼠，其中1只在飼養(yǎng)過程中死亡，存活率為96.00%(24/25)。75只造模大鼠11只在手術(shù)后3 d內(nèi)死亡，剩下64只隨機(jī)分為TXL組和MI組，每組32只。到藥物灌胃治療結(jié)束時(shí)，TXL組有3只大鼠死亡，存活率為90.62%，MI組有10只死亡，存活率為68.75%。TXL組的大鼠存活率高于MI組(P＜0.05)。

2 心肌IL-1β及ET-1水平的測(cè)定結(jié)果

Sham組心肌組織未能檢測(cè)出IL－1β，而TXL組梗死周邊區(qū)IL－1β水平顯著低于MI組(P＜0.01)。與sham組相比，MI組梗死周邊區(qū)的ET－1水平顯著升高(P＜0.01)。經(jīng)TXL治療后，TXL組心梗周邊區(qū)的ET－1水平較MI組下降(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The levels of IL－1β and ET－1 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖1 3組動(dòng)物心肌IL-1β及ET-1水平的比較

3 Cx43 mRNA的表達(dá)結(jié)果

RT－PCR結(jié)果顯示，MI組梗死周邊區(qū)Cx43的mRNA水平較sham組顯著下降，而給予TXL治療后，TXL組梗死周邊區(qū)Cx43的mRNA水平較MI組升高(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of Cx43 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs MI group.圖2 3組動(dòng)物心肌梗死周邊區(qū)Cx43 mRNA表達(dá)的比較

4 Cx43的蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Cx43及p－Cx43蛋白在3組動(dòng)物間的表達(dá)，結(jié)果顯示，與sham組相比，MI組梗死周邊區(qū)心肌Cx43蛋白總表達(dá)量及磷酸化水平均顯著下降(P＜0.01)。給予TXL治療后，梗死周邊區(qū)的Cx43蛋白總表達(dá)量及磷酸化水平均較MI組明顯升高(P＜0.01)。此外，雖然TXL組梗死周邊區(qū)的Cx43蛋白總表達(dá)量較sham組下降(P＜0.05)，但磷酸化的Cx43蛋白水平在2組間卻無明顯差異(P＞0.05)，見圖3。

5 在體VA誘發(fā)的結(jié)果

Sham組只有1只動(dòng)物誘發(fā)出了非持續(xù)性VA，VA誘發(fā)率為8.33%。MI組的VA誘發(fā)率為90.00%，且66.70%為持續(xù)性VA，與sham組比較，差異顯著(P＜0.01)。經(jīng)TXL治療4周后，VA的誘發(fā)率為52.94%，持續(xù)性VA的誘發(fā)率為17.64%，均較MI組明顯減低(P＜0.05)，見圖4。

6 Cx43的含量及分布結(jié)果

Sham組的Cx43多分布在心肌閏盤處，與心肌纖維走行垂直;MI組的Cx43表達(dá)較sham組明顯減少(P＜0.01)，且?guī)缀蹙植加谛募?cè)面，與心肌纖維走行平行;TXL組的Cx43表達(dá)較MI組增加(P＜0.01)，且可見部分Cx43分布于閏盤處，見圖5。

Figure 3.The protein level of Cx43 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖3 3組動(dòng)物心肌Cx43蛋白表達(dá)的比較

Figure 4.The typical ECG images of VA and the incidence of VA in the rats with different treatments.圖4 3組動(dòng)物典型的室性心律失常誘發(fā)結(jié)果圖

Figure 5.The immunofluorescent staining for Cx43 expression(arrows)from the border zone of the cardiac tissues in the rats with different treatments(×400).Cx43 signals were mainly located at end－to end apposition among the neighboring cells in the sham group.In contrast，infarction markedly decreased Cx43 expression.After administration of TXL，Cx43 signals were increased.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖5 3組心肌梗死周邊區(qū)Cx43的表達(dá)及分布情況

討論

心肌梗死后常易并發(fā)各種心律失常，其中VA尤為多見，是心肌梗死患者發(fā)生心源性猝死的主要原因［2，6］。TXL是一種臨床上廣泛應(yīng)用的中成藥，由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、赤芍、土鱉蟲等12種中藥成分組成，具有益氣通絡(luò)、化瘀通絡(luò)、流氣通絡(luò)等作用。既往研究證實(shí)，TXL可通過改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)及電重構(gòu)(包括縮短心肌動(dòng)作電位時(shí)程、延長有效不應(yīng)期及減小心室跨壁離散度等)進(jìn)而抑制心肌梗死后VA的發(fā)生［4，7］。近些年的一些研究顯示心肌梗死后Cx43的重構(gòu)也參與了心肌梗死后VA的發(fā)生［1－2］。然而，TXL對(duì)心肌梗死后Cx43重構(gòu)的影響及其與梗死后VA的關(guān)系既往并無相關(guān)研究。本研究首次對(duì)這一問題進(jìn)行了初步探討，以期為TXL治療心肌梗死后VA提供一定的理論依據(jù)。

哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞間廣泛存在縫隙連接蛋白，心室組織中以Cx43為主，它與心臟維持正常的電傳導(dǎo)密切相關(guān)。在一些病理?xiàng)l件下，為適應(yīng)心功能的變化，縫隙連接蛋白可在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生重構(gòu)。這種重構(gòu)容易誘發(fā)各種心功能紊亂，其中惡性心律失常的發(fā)生尤為多見［8］。心肌梗死后心肌細(xì)胞Cx43的重構(gòu)，主要涉及Cx43表達(dá)量顯著減少、側(cè)面化分布增加及磷酸化水平降低3個(gè)方面。其中，Cx43表達(dá)量顯著減少可引起心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)速度減慢［9］。而Cx43的側(cè)面化分布一方面使心肌細(xì)胞電信號(hào)由各向異性傳導(dǎo)的形式轉(zhuǎn)變?yōu)槔@彎式傳導(dǎo)，為折返的發(fā)生提供基礎(chǔ)［10］;另一方面這些側(cè)面化分布的Cx43可以以半通道的形式開放釋放ATP，同時(shí)促進(jìn)Na+通過Cx43半通道內(nèi)流誘發(fā)延遲后除極，進(jìn)而誘發(fā)心律失常［11－12］。此外，有研究證實(shí)Cx43的磷酸化水平與Cx43的分布特點(diǎn)有明顯的相關(guān)性，具體表現(xiàn)為磷酸化Cx43水平增加則Cx43多分布于心肌閏盤處，而非磷酸化Cx43水平增加則Cx43多分布于心肌側(cè)面［13］，即心肌梗死后Cx43磷酸化水平的降低可促進(jìn)Cx43的側(cè)面化分布，進(jìn)而為心律失常的發(fā)生提供條件?？傊珻x43這3個(gè)方面的重塑在一定程度上發(fā)揮協(xié)同作用，最終導(dǎo)致VA的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠經(jīng)TXL治療后可以上調(diào)梗死周邊區(qū)Cx43的表達(dá)量、促進(jìn)Cx43的正常分布及增加Cx43磷酸化水平，這可能是TXL可以減少心肌梗死后VA發(fā)生的重要原因。

此外，既往研究顯示心肌組織中的IL－1β及ET－1水平與心肌Cx43蛋白表達(dá)量有關(guān)［14－15］，其中IL－1β可通過核因子κB途徑抑制Cx43合成，而ET－1則通過PLC/DAG/PKC途徑使Cx43過度磷酸化而誘導(dǎo)Cx43的降解。在本研究中，TXL減少了心肌梗死大鼠梗死周邊區(qū)IL－1β及ET－1水平，我們推測(cè)這可能與TXL上調(diào)梗死周邊區(qū)Cx43的表達(dá)量有關(guān)。

總之，TXL可降低心肌梗死大鼠的VA發(fā)生率，其機(jī)制可能與TXL抑制心肌梗死后Cx43重構(gòu)有關(guān)。

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Effects of Tongxinluo on connexin 43 remodeling and ventricular arrhythmia after myocardial infarction in rats

LI Hua－bo，CHEN Shi－jian，HU Jian－h(huán)ua，WANG Lian－kai

(Department of Cardiovascular Diseases，The Min Da Hospital Affiliated to Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China.E-mail:1249245691@qq.com)

AIM:To determine the effects of Tongxinluo(TXL)on connexin 43(Cx43)remodeling and ventricular arrhythmia(VA)after myocardial infarction(MI)in rats.METHODS:Male SD rats were randomly divided into sham－operated(sham)group(n=25)and operation group(n=75).The left anterior descending(LAD)was ligated in operated group，while the rats in sham group only underwent pericardiotomy.The rats in operation group which survived for 3 d after operation were randomly assigned to TXL group and MI group.The rats in TXL group was administrated with TXL (2 g·kg－1·d－1，intragastric administration)for 4 weeks，while normal saline was applied to the rats in sham group and MI group.The levels of interleukin－1β(IL－1β)and endothelin－1(ET－1)in the tissue from the border zone were measured by ELISA after treatment.The distribution and the mRNA and protein expression of Cx43 were detected by immunohistochemical staining，RT－PCR and Western blotting，respectively.The burst pacing was used to induce ventricular arrhythmia (VA).RESULTS:Compared with sham group，the levels of IL－1β and ET－1 and the incidence of VA were significantly increased，while the mRNA and protein expression of Cx43 was markedly reduced with irregular distribution in MI group (P＜0.05).Compared with MI group，the levels of IL－1β and ET－1 and the incidence of VA were significantly reduced，while the expression of Cx43 at mRNA and protein levels was markedly increased with augmented linear distribution in the myocardial cell intercalated disc in TXL group(P＜0.05).CONCLUSION:TXL reduces the incidence of VA after MI via inhibiting the Cx43 remodeling.

Myocardial infarction;Tongxinluo;Connexin 43;Ventricular arrhythmia

R542.2+2;R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.015

1000－4718(2015)02－274－05

2014－09－03

2015－01－04

恩施州2013年農(nóng)社領(lǐng)域技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目

△通訊作者Tel:0718－8301036;E－mail:1249245691@qq.com