周志剛，李志忠，林永新，邵建立，焦根龍，孫國棟，周孝斌，丁志勇

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510630)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成類神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究*

周志剛，李志忠△，林永新，邵建立，焦根龍，孫國棟，周孝斌，丁志勇

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510630)

目的:采用不同細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化成類神經(jīng)元，為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。方法:采用Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞。取第5代細(xì)胞隨機(jī)分成A、B、C、D 4組，在A組基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入bFGF，B組中加入bFGF和BDNF，C組中加入bFGF、BDNF和BHA誘導(dǎo)培養(yǎng)，D組為對照組，使用含有10%胎牛血清的DMEM－F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)2周后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞的nestin、NEFH和GFAP mRNA表達(dá)情況，并通過原子力顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的的變化。結(jié)果:Ⅱ型膠原酶消化法能成功分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)CD29、CD44和CD105，而CD34、CD45和HLA－DR均未見表達(dá)。經(jīng)定向誘導(dǎo)分化成類神經(jīng)元后，原子力顯微鏡觀察細(xì)胞表面突起增多，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示nestin在A、B、C組均呈陽性表達(dá)，NEFH在A、B組呈陽性表達(dá)，而GFAP在A、B、C、D 4組均不表達(dá)。A、B組nEFH和nestin表達(dá)具有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，所培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增迅速，生物學(xué)性狀穩(wěn)定;與bFGF單獨(dú)處理相比，bFGF聯(lián)合BDNF更能有效誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化成類神經(jīng)元。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;分化;神經(jīng)元樣細(xì)胞

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)主要是車禍或墜落傷所致，因其呈高發(fā)生率、高致殘率、高耗費(fèi)、低死亡率的特點(diǎn)而成為全球性醫(yī)療和社會共同關(guān)注的問題。目前SCI尚無有效的臨床治療對策，仍然是醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題［1］。干細(xì)胞移植治療SCI是近年來研究熱點(diǎn)，主要是通過細(xì)胞移植來促進(jìn)變性神經(jīng)元的再生和抑制膠質(zhì)瘢痕形成，達(dá)到修復(fù)受損的神經(jīng)通路和突觸連接，從而恢復(fù)癱瘓肢體的功能［1－2］。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具備取材方便、擴(kuò)增迅速、免疫原性低、能自體移植等優(yōu)點(diǎn)，成功解決了胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等種子細(xì)胞移植可能遇到的來源以及倫理等諸多問題，成為細(xì)胞移植治療脊髓損傷最具潛力的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用不同的細(xì)胞生長因子對hUCMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，2周后原子力顯微鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化，熒光定量PCR檢測細(xì)胞誘導(dǎo)后神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)絲蛋白H(neurofilament protein H，NEFH)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和巢蛋白(nestin)mRNA的表達(dá)情況，直接證實(shí)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有神經(jīng)元的部分功能(稱之為類神經(jīng)元)。目的在于探索一種有效的誘導(dǎo)方法，為hUCMSCs移植治療急性脊髓損傷提供合理的方法和客觀的依據(jù)。

材料和方法

1 材料

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco;Ⅱ型膠原酶、碘化丙啶(propidium iodide，PI)和丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)購自上海生工;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain－derived neurotrophic factor，BDNF)購自Sigma;M－MLV、RNase、Random primer和RNase inhibitor購自TaKa－Ra;Trizol購自Invitrogen。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 hUCMSCs的分離和原代細(xì)胞的培養(yǎng)經(jīng)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)、產(chǎn)婦知情同意后取足月剖宮產(chǎn)臍帶10～15 cm，無菌條件下放入盛有PBS溶液的廣口瓶中，4℃冰箱保存。超凈臺紫外線照射30分鐘后，取出臍帶，用含1%青、鏈霉素(雙抗)的PBS液反復(fù)沖洗后去除臍動靜脈及臍帶外膜，用眼科剪將臍帶剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm的小塊。將組織塊轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入適量0.1%Ⅱ型膠原酶，采用酶消化法分離、提取所需細(xì)胞。臺盼蘭(0.4%)常溫染色3 min后，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度以1×1010/m2的密度種植于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后半量換液，72 h后全量換液，以后每3～4 d換液1次，直至細(xì)胞基本鋪滿瓶底后再傳代培養(yǎng)。

2.2 定向誘導(dǎo)hUCMSCs向類神經(jīng)元分化取第5代(P5)細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度，種1×105個(gè)細(xì)胞至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，隨機(jī)分成A、B、C、D 4組，待細(xì)胞貼壁后使用誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每3天換液1次。其中A組使用含有10 μg/L bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)，B組用含有250 μg/L BDNF和10 μg/L bFGF的DMEM/ F12培養(yǎng)，C組用0.1 mmol/L BHA、250 μg/L BDNF和10 μg/L bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)，D組為空白對照組，使用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.3 檢測方法

2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測hUCMSCs表面抗原

0.125 %胰蛋白酶消化P3細(xì)胞，加入PBS離心后去掉胰蛋白酶，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)1×109/L以上。將待檢細(xì)胞樣品分裝后陰性對照管加入鼠IgG－FITC、IgGPE，其它管分別加入鼠抗人CD105－FITC、CD29－PE、CD45－FITC、CD44－FITC、HLA－DR－PE和CD34－PE，各20 uL，室溫孵育30min后，流式細(xì)胞儀檢測。

2.3.2 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后原子力顯微鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)取P5細(xì)胞，消化后加入適量培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×105，種植于6孔板的無菌蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁生長后培養(yǎng)2 d，使用多聚甲醛固定后原子力顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測nestin、GFAP和NEFH細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后收集細(xì)胞沉淀，采用Trizol溶液提取RNA，具體操作按照Invitrogen Trizol使用說明書。在RNase free的PCR管中取1 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA加入1 μg用于PCR實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增條件是:95°C 5 min;95°C 15 s，50°C 15 s，72°C 32 s，30個(gè)循環(huán);72°C 7 min。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長特點(diǎn)

酶消化法培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡下觀察可見有部分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞形態(tài)不一大部分呈梭形、紡錘形，少部分呈多角形，細(xì)胞遮光性較差。原代培養(yǎng)5 d后貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，開始出現(xiàn)細(xì)胞集落部分融合成片狀，細(xì)胞變長，呈長而扁平的梭形類似于成纖維細(xì)胞形態(tài)，高倍鏡下可見細(xì)胞周圍呈現(xiàn)不規(guī)則突起。10 d后細(xì)胞基本鋪滿瓶底，集落呈漩渦狀或輻射狀，大部分細(xì)胞融合在一起，細(xì)胞間隙不清楚，細(xì)胞遮光性較好見，圖1。

Figure 1.Human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs)cultured for different time(×150).圖1 原代培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

2 流式細(xì)胞術(shù)分析hUCMSCs的細(xì)胞表面分子表達(dá)特征及細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示細(xì)胞大部分處于靜止期(G0/G1期)，表明只要有少部分細(xì)胞處于增殖期即可大量增殖，顯示出hUCMSCs強(qiáng)大的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示hUCMSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD105等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志，說明我們分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞是hUCMSCs而不是其它細(xì)胞;不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞標(biāo)志和人類白細(xì)胞抗原HLA－DR，說明其免疫原性低。

3 原子力顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)在細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)、物質(zhì)交換、支撐細(xì)胞和定向分化等方面具有關(guān)鍵的作用，故研究hUCMSCs定向誘導(dǎo)分化后細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的變化具有極為重要的意義。誘導(dǎo)培養(yǎng)后14 d觀察細(xì)胞核表面5 μm超微結(jié)構(gòu)，具體情況如下:A組細(xì)胞呈星形，細(xì)胞表面可見數(shù)量不多的突起，細(xì)胞核表面顆粒的直徑分布在50～150 nm，大小顆粒的數(shù)目較均勻;B組細(xì)胞呈神經(jīng)元樣改變，細(xì)胞周邊可見大小不一的樹突狀結(jié)夠，細(xì)胞核表面顆粒較大，直徑在100～180 nm之間，直徑為100 nm和150 nm的顆粒數(shù)目較多;C組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核表面顆粒分布在150～350 nm，考慮為BHA對細(xì)胞的毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞骨架重塑，細(xì)胞皺縮的結(jié)果;D組為空白對照組，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的的長梭形，細(xì)胞核邊界清楚，其表面顆粒小且較均勻，直徑在40～60 nm之間，見圖2。

4 熒光定量PCR檢測結(jié)果

由總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示GFAP在4個(gè)組內(nèi)均未見表達(dá)，NEFH在A組和B組有表達(dá)，nestin在A、B、C組均有表達(dá)，但C組表達(dá)量極少。且B組NEFH及nestin的表達(dá)量明顯高于其它組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

討論

干細(xì)胞移植治療SCI是近年來研究熱點(diǎn)，hUCMSCs是一種理想的干細(xì)胞種子細(xì)胞。自從2002年Woodbury等［3］首次報(bào)道體外將骨髓MSCs誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元以來，經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者的不斷探索目前體外誘導(dǎo)MSCs分化成神經(jīng)元的誘導(dǎo)大致分為4類:抗氧化劑誘導(dǎo)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)、中藥誘導(dǎo)、MSCs和神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)。Woodbury等［3］將抗氧化劑2－巰基乙醇、二甲基亞砜加入BMSCs中，首次證明了骨髓MSCs誘導(dǎo)后逐漸向成熟神經(jīng)元分化。程朝輝等［4］采用bFGF、EGF、NGF、GM和ATP組成的復(fù)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)48 h后免疫組化檢測nestin和NF呈陽性表達(dá)而GFAP呈陰性。Alexanian等［5］將小鼠源性的骨髓MSCs與神經(jīng)干細(xì)胞以1∶1的比例混合后使用神經(jīng)干細(xì)胞生長支持性培養(yǎng)基培養(yǎng)后可遠(yuǎn)觀察到神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生，且這些細(xì)胞陽性表達(dá)神經(jīng)絲微管蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白。項(xiàng)鵬等［6］和馬廉等［7］采用含復(fù)方丹參注射液為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)UCMSCs，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞陽性表達(dá)巢蛋白、神經(jīng)微管和神經(jīng)微絲、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白。以抗氧化劑為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)途徑雖然能短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但其誘導(dǎo)劑大多具有毒性不能在臨床實(shí)驗(yàn)中使用，Lu等［8］認(rèn)為是因?yàn)榧?xì)胞毒性損害、胞漿收縮、細(xì)胞骨架破壞導(dǎo)致細(xì)胞呈神經(jīng)元樣改變，Neuhuber等［9］認(rèn)為誘導(dǎo)后出現(xiàn)的細(xì)胞突起是細(xì)胞骨架因子F－肌動蛋白裂解后重建的結(jié)果，而非真正的樹突或軸突。細(xì)胞因子誘導(dǎo)途徑與其它途徑相比更加安全，是具有廣闊前景的誘導(dǎo)方法。

Figure 2.The cell surface morphology detected by atomic force microscope(AFM)14 d after induction.A:the cell surface morphology of A group induced by 10 μg/L bFGF;B:the cell surface morphology of B group induced by 250 μg/L NGF and 10 μg/ L bFGF;C:the cell surface morphology of C group induced by 0.1 mmol/L BHA for 24 h followed by 250 μg/L NGF and 10 μg/L bFGF;D:the cell surface morphology of D group cultured only in DMEM/F12.圖2 培養(yǎng)14 d后原子力顯微鏡的觀察結(jié)果

Figure 3.The expression level of NEFH and nestin mRNA in hUCMSCs 14 d after induction.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs D group.圖3 熒光定量PCR檢測結(jié)果

bFGF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在體內(nèi)能維持神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活，誘導(dǎo)神經(jīng)元合成神經(jīng)特異性基因產(chǎn)物以及乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)交感、副交感神經(jīng)元軸突生長，在體外bFGF是具有廣泛生物活性的肝素黏多肽，能促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖與分化，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖并決定其橫向分化，作用機(jī)制可能與其參加了MSCs向神經(jīng)元分化的啟動［10－11］，林麗等［12］證實(shí)bFGF可促進(jìn)hUCMSCs增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用bFGF和BDNF 2種細(xì)胞因子能夠有效誘導(dǎo)hUCMSCs分化成類神經(jīng)元，NEFH和nestin表達(dá)陽性。NEFH及nestin是神經(jīng)元的標(biāo)志物，說明誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有神經(jīng)元的部分特征。僅采用bFGF也能夠誘導(dǎo)hUCMSCs分化成類神經(jīng)元，但是效率不高;采用bFGF、BDNF和BHA三者聯(lián)合誘導(dǎo)方案幾乎未能誘導(dǎo)hUCMSCs分化成類神經(jīng)元。這說明bFGF可能是誘導(dǎo)必須的，而BDNF能夠促進(jìn)分化過程，BHA卻抑制分化過程。關(guān)于bFGF和BDNF誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元分化的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的深入研究，推測可能是這些細(xì)胞因子作為神經(jīng)細(xì)胞生長、發(fā)育、分化的調(diào)節(jié)劑，形成了體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育所需的微環(huán)境從而促進(jìn)細(xì)胞分化。Quirici等［13］認(rèn)為MSCs表面存在著親和力較低的神經(jīng)生長因子受體，當(dāng)細(xì)胞因子單獨(dú)或者聯(lián)合作用于MSCs時(shí)，可以與具有多向分化潛能的MSCs表面受體結(jié)合，進(jìn)而激活復(fù)雜的胞內(nèi)反應(yīng)，從而促進(jìn)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示出類似的結(jié)果。

總之，采用DMEM/F12培養(yǎng)基添加250 μg/L BDNF及10 μg/L bFGF能夠誘導(dǎo)hUCMSCs分化成類神經(jīng)元，為下一步對誘導(dǎo)機(jī)制的研究以及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Differentiation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord

ZHOU Zhi－gang，LI Zhi－zhong，LIN Yong－xin，SHAO Jian－li，JIAO Gen－long，SUN Guodong，ZHOU Xiao－bin，DING Zhi－yong

(Department of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China，E-mail:lizhizhong1@medmail.com.cn)

AIM:To explore an ideal method to induce the differen－tiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs)into neuron－like cells and to provide some evidence for the transplantation of hUCMSCs for spinal cord injury.METHODS:The hUCMSCs were isolated from human umbilical cord digested with collagenaseⅡ.The hUCMSCs was verified by flow cytometry analysis.The passage 5 cells were randomly divided into 4 groups.The differentiation of hUCMSCs was induced by bFGF in group A，bFGF and BDNF in group B，or BHA，bFGF and BDNF in group C，while the cells in group D served as a control group cultured with DMEM－F12 and 10%FBS.Two weeks later，the expression of nestin，neurofilament protein H(NEFH)and glial fibrillary acidic protein(GFAP)was detected by realtime PCR and immunocytochemistry.The morphological changes of cells were observed under an atomic force microscope.RESULTS:Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by enzyme digestion.hUCMSCs expressed CD29，CD44 and CD105，but no CD34，CD45 or HLA－DR.After cultured with inducing medium for 2 weeks，the cells were successfully induced into neuron－like cells.The appearance of the cells had great change.The induced hUCMSCs developed round cell bodies with multiple neurite－like extensions observed under an atomic force microscope.The result of real－time PCR showed that nestin was positive in A，B and C groups，and NEFH was positive in A and B groups，but GFAP was negative in 4 groups.The difference of nestin and NEFH expression among the induced groups was signifi－cant(P＜0.05).CONCLUSION:Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by enzyme digestion in vitro，and all the hUCMACs presented stable biological properties.Moreover，hUCMSCs were induced to differentiate into neuron－like cells in vitro via bFGF combined with BDNF.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Differentiation;Neuron－like cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.007

1000－4718(2015)02－229－05

2013－12－29

2014－11－28

廣州市科技計(jì)劃(No.12C32071662);廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(No.2013113);暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育

專項(xiàng)基金(No.2012103);暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育專項(xiàng)基金(No.2013208)

△通訊作者Tel:020－38688617;E－mail:lizhizhong1@medmail.com.cn