劉 雷 陳國昌 宋振云 郜恒駿 陳衛(wèi)昌

江蘇省宜興市人民醫(yī)院消化內科1(214200) 生物芯片上海國家工程研究中心2蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化科3

轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路為一重要的細胞內信號轉導通路，參與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、創(chuàng)傷愈合、炎癥反應等多種生理和病理生理過程。Runx3和Smad4是近年發(fā)現的抑癌基因，兩者為TGF-β信號通路中的關鍵分子，其異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［1-2］。p21和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)同樣在TGF-β信號通路中發(fā)揮重要作用，p21可通過抑制CDKs復合物活性協(xié)調細胞周期、DNA修復、細胞凋亡等因素，進而對腫瘤產生影響［2-3］。近年來，組織芯片技術已越來越多地應用于惡性腫瘤相關研究，本研究應用組織芯片技術聯合免疫組化方法檢測并分析Runx3、Smad4、Cdk2、p21在胃癌中的表達及其與胃癌臨床病理特征和預后的關系，探討四者在胃癌中的生物學意義及其用于胃癌預后判斷的臨床價值。

材料與方法

一、標本來源

收集蘇州大學附屬第一醫(yī)院2004年10月-2007年5月胃癌根治手術標本130例，其中男101例，女29例，年齡27 ～80歲，平均(62.7 ±15.2)歲。入選病例術前均未行化、放療，診斷經術后病理檢查證實，病史資料完整，出院后通過電話、信件隨訪，截止日期為2011年10月1日。共獲得癌組織石蠟塊130例，癌旁組織248例(距腫瘤邊緣2 cm以內和5 cm以外各124例)，胃癌組織學分型和臨床病理分期分別參照2000年WHO推薦的分型標準和2002年第6版UICC/AJCC TNM分期。

二、組織芯片制作

供體組織蠟塊常規(guī)切片、HE染色，由病理專家作二次診斷，并在切片上標記典型病變部位。使用組織芯片制作儀(Beecher Instruments Inc.)在受體蠟塊(空白蠟塊)上打孔(直徑1.0 mm和1.5 mm)，根據HE染色切片上標記的病變部位，在供體組織蠟塊的相應位置獲取相同直徑的組織芯，置入受體蠟塊陣列孔中，記錄組織編號。每塊組織取2個組織芯，共制成4塊陣列塊，4μm厚連續(xù)切片，組織芯片切片中的每個點均經病理診斷證實。

三、免疫組化染色和結果判斷

兔抗人Runx3、Cdk2多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，鼠抗人Smad4單克隆抗體購自R＆D Systems，Inc.，鼠抗人p21單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。采用EnVision二步法，嚴格按試劑盒(DAKO公司)說明書進行操作。于光學顯微鏡下隨機選取5個高倍視野，計數不少于1000個細胞，計算染色細胞百分率。異常表達判斷標準均參照相關文獻:①Runx3，細胞核出現棕黃色或褐色顆粒，染色細胞≥10%為正常表達，＜10%為異常表達;②Smad4，細胞質和(或)細胞核出現黃色或褐色顆粒，染色細胞≥50%為正常表達，＜50%為異常表達;③Cdk2，細胞膜、細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒，染色細胞≤10%為正常表達，＞10%為異常表達;④p21，細胞核出現棕黃色或褐色顆粒，染色細胞＞5%為正常表達，≤5%為異常表達。

四、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法;相關性的分析采用 Spearman秩相關系數;以Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計算生存率，兩組間比較采用log-rank檢驗;以Cox比例風險模型行預后因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 在不同胃組織中的表達

130 例胃癌組織中，Runx3、Smad4、Cdk2、p21 異常表達率分別為 67.7%、35.4%、63.8% 和 70.0%，248 例癌旁組織中則分別為 14.1%、12.5%、18.1%和37.1%，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。將癌旁非癌組織根據病理診斷分組作進一步分析，從正常胃組織、慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生至胃癌，四種蛋白異常表達率大致呈上升趨勢，其中正常胃組織、慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎和腸上皮化生組織均顯著低于胃癌組織(P＜0.05)，而異型增生組織僅Runx3異常表達率顯著低于胃癌組織(P＜0.05)，Smad4、Cdk2、p21異常表達率與胃癌組織無明顯差異(P ＞0.05)(圖1、表1)。

二、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達與胃癌臨床病理特征的關系

分析顯示，Runx3異常表達與胃癌組織學分型和淋巴結轉移有關(P＜0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤深度和TNM分期無關((P＞0.05);Smad4和p21異常表達僅與胃癌組織學分型有關(P ＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、部位、淋巴結轉移、浸潤深度和TNM分期無關(P＞0.05);Cdk2異常表達與胃癌組織學分型、淋巴結轉移和TNM分期有關(P＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、部位和浸潤深度無關(P＞0.05)(表2)。

三、胃癌組織中 Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達的相關性

130例胃癌組織中，Runx3與Smad4均異常表達者45例，均正常表達者41例，兩者呈正相關(rs=0.387，P＜0.05);Runx3與p21均異常表達者85例，均正常表達者36例，兩者呈正相關(rs=0.840，P＜0.05);Runx3與Cdk2均異常表達者78例，均正常表達者37例，兩者呈負相關(rs= －0.312，P ＜0.05);Smad4與p21均異常表達者43例，均正常表達者36例，兩者呈正相關(rs=0.298，P ＜0.05);Smad4 與Cdk2均異常表達者26例，均正常表達者27例，兩者間無相關性(rs= －0.089，P＞0.05);Cdk2與 p21均異常表達者52例，均正常表達者8例，兩者間無相關性(rs= －0.211，P ＞0.05)。

四、Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達與胃癌患者生存率的關系

130例患者隨訪53～84個月，中位隨訪期65個月，死亡74例，失訪12例，隨訪率為90.8%，總體中位生存時間為32個月，5年生存率為37.3%。Runx3、Smad4、p21異常表達組5年生存率分別顯著低于相應正常表達組(P＜0.05)，Cdk2異常表達與正常表達組間5年生存率無明顯差異(P＞0.05)(表3)。Cox比例風險模型多因素分析顯示，在各項潛在預后因素(性別、年齡、腫瘤大小、部位、組織學分型、淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期以及Runx3、Smad4、Cdk2、p21 表達)中，Runx3 和 Smad4為胃癌患者的獨立預后因素。

圖1 Runx3、Smad4、Cdk2、p21在正常胃組織和胃癌組織中的表達(免疫組化EnVision二步法，×200)

表1 Runx3、Smad4、Cdk2、p21在不同胃組織中的異常表達情況n(%)

表2 Runx3、Smad4、Cdk2、p21表達與胃癌臨床病理特征的關系(n)

表3 Runx3、Smad4、Cdk2、p21異常表達與正常表達組生存情況比較

討 論

TGF-β信號通路在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，該通路相關分子主要包括TGF-β受體(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)、Runx3、Smad4、Cdk2、p21、p27、cmyc等［2］。在 TGF-β-Smad 信號轉導過程中，Runx蛋白(包括Runx3)介導Smads復合物從胞質轉入胞核，兩者共同參與細胞分化、細胞凋亡、細胞周期等的調控［4］。研究發(fā)現Runx3失活可引起小鼠胃黏膜上皮細胞增殖增強和凋亡抑制，導致胃黏膜異常增生甚至癌變，Runx3的抑癌機制至少部分與協(xié)同TGF-β-Smad 信號誘導 p21 表達有關［5］;胃癌組織中Smad表達明顯下調，并與預后不良有關［6］。Runx3與Smad4協(xié)同誘導p21表達，使細胞周期阻滯于G1期，p21表達激活又可抑制Cdk2、Cdk4，進一步發(fā)揮抑癌作用。由此可見，TGF-β信號通路中的Runx3、Smad4、Cdk2、p21之間存在相互影響。本研究分析了這四種蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達情況、四者與胃癌臨床病理特征和預后的關系以及四者間的相關性，發(fā)現胃癌組織中Runx3、Smad4、p21表達下調或缺失，Cdk2表達上調，四者分別與胃癌組織學分型、淋巴結轉移、TNM分期中的一項或多項有關;除Cdk2僅與 Runx3相關外，Runx3、Smad4、p21三者的異常表達兩兩相關，且均與預后不良有關，其中Runx3和Smad4是胃癌患者的獨立預后因素。

本組130例胃癌組織中67.7%存在Runx3異常表達，而248例癌旁組織中Runx3異常表達率僅為14.1%，從正常胃組織、慢性胃炎、癌前病變(腸上皮化生和異型增生)至胃癌的演進過程中，Runx3異常表達率逐步上升，提示Runx3或可作為早期胃癌的預測指標，對結直腸腫瘤的研究同樣顯示Runx3失活是結直腸癌發(fā)生的早期事件［7］，與本研究結果一致。肝細胞癌組織中亦存在Runx3表達下調或缺失［8］。本研究中Smad4異常表達率從正常胃組織至癌前病變上升趨勢并不明顯，從癌前病變至胃癌則有較明顯的增加，提示Smad4失活屬于癌變晚期分子事件，與國外文獻報道一致［9］。

Cdk2是CDKs蛋白家族的重要成員，作為細胞周期正性調節(jié)因子，在多種惡性腫瘤中表達上調，增加腫瘤細胞的惡性表型和侵襲性［10］。p21為CDKs抑制劑之一，既往觀點認為其可誘導細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞生長，然而近年研究卻發(fā)現p21在前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌以及多種鱗狀細胞癌中呈高表達，表明p21在不同惡性腫瘤中可呈現抑癌或促癌活性［3］。本研究發(fā)現p21在胃癌中表現為抑癌活性，p21表達正常的胃癌患者5年生存率顯著長于表達低下者。p21在不同惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用可能與以下因素有關［3］:①p21基因多態(tài)性導致其功能的多樣性，且 p21受 p53、Cdk2、Smads等多種分子影響;②p21可通過激活E2F、抑制Cdk2而抑制細胞周期，但同時又可抑制細胞凋亡，調節(jié)多種轉錄因子表達，參與DNA修復。

綜上所述，本研究發(fā)現TGF-β信號通路中的Runx3、Smad4、Cdk2、p21 可相互影響并可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，其中Runx3、Smad4、p21表達與胃癌患者的生存期有關，異常表達組5年生存率顯著低于正常表達組，Cox比例風險模型提示Runx3和Smad4為胃癌患者的獨立預后因素。然而，胃癌發(fā)生的影響因素眾多，本研究標本選取時未剔除術前曾服用中藥者以及幽門螺桿菌(Hp)感染病例(Hp感染可能對TGF-β信號通路產生激活作用)，且Runx3、Smad4、p21之間存在兩兩相關關系，因此Runx3和Smad4能否作為判斷胃癌患者預后的指標之一，尚有待進一步研究。

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6 陸斌，周永寧，李強，等.胃癌組織 TGF-βRⅡ、Smad4、Smad7的表達及其與臨床病理特征和生存的關系［J］.癌癥，2009，28(5):538-542.

7 Subramaniam MM，Chan JY，Soong R，et al.RUNX3 inactivation in colorectal polyps arising through different pathways of colonic carcinogenesis［J］. Am J Gastroenterol，2009，104(2):426-436.

8 Li X，Zhang Y，Zhang Y，et al.RUNX3 inhibits growth of HCC cells and HCC xenografts in mice in combination with adriamycin［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(5):669-676.

9 Maitra A，Molberg K，Albores-Saavedra J，et al.Loss of Dpc4 expression in colonic adenocarcinomas correlates with the presence of metastatic disease［J］.Am J Pathol，2000，157(4):1105-1111.

10 Hongo F，Takaha N，Oishi M，et al.CDK1 and CDK2 activity is a strong predictor of renal cell carcinoma recurrence［J］.Urol Oncol，2014，32(8):1240-1246.