王芮東，高文庚，李 楠，張 波，王 焙

(1.運城學院 生化實驗中心;2.運城學院生命科學系，山西 運城044000)

柿子，也稱為米果、猴棗，屬于柿科(Ebenaeeae)柿屬(Diospyros)，我國柿樹的栽培距今已有三千多年的歷史［1－2］，我國柿樹資源比較豐富，據(jù)統(tǒng)計大約有柿屬植物40多種，柿子品種800余個［3］。柿子味甘、澀，性寒，有清熱去燥、潤肺化痰、止渴生津、健脾等功效［4－8］。柿子營養(yǎng)豐富，每100 g柿子中含碳水化合物25 g，糖分28 g，蛋白質(zhì)1.36 g、脂肪0.2 g、磷 19 mg、鐵 8 mg、鈣 10 mg、維生素 C16 mg，還含有胡蘿卜素等多種營養(yǎng)，并且含有大量單寧和果膠［9－12］。

我國民間以柿子為原料釀制發(fā)酵酒已有千年以上的歷史，但多屬于自釀自飲，從沒有形成大規(guī)模生產(chǎn)。針對近年來我國柿子產(chǎn)量大、價格低廉、深度開發(fā)利用少、經(jīng)濟附加值低的現(xiàn)狀，故優(yōu)化柿子酒發(fā)酵工藝參數(shù)，是柿子酒生產(chǎn)中需要迫切解決的問題，也是柿子產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的需要［13］。周悅等對柿酒的發(fā)酵條件進行單因素及正交試驗，以最終柿子酒的酒精度、殘?zhí)呛考案泄僭u定為指標，結(jié)果表明，酵母菌在 pH4.5、發(fā)酵溫度 22℃、裝液量60%、接種量0.35 g/L的條件下，柿酒的酒精度為11.83%，感官評分95分［14］。本試驗采用正交試驗對柿子酒的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，利用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對此成品柿子酒的香氣成分進行分析，釀制出風味好，口感佳的柿子酒，使柿子資源得到充分利用，提高其利用率。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

柿子:個大、色紅，充分成熟，購自運城市鹽湖區(qū)北相鎮(zhèn);白砂糖(食品級):廣西南寧桂華糖業(yè)有限公司;果膠酶:山東蘇柯漢生物工程股份有限公司;檸檬酸(食品級):河南天健化工產(chǎn)品有限公司;活性干酵母:湖北安琪酵母股份公司。

1.1.2 試驗試劑

硫酸銅、亞硫酸、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉均為分析純試劑，天津市瑞金特化學品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ－2型組織搗碎勻漿機:江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;SHP－250生化培養(yǎng)箱:上海樹立儀器儀表有限公司;手持糖度計:上海貝嶺股份有限公司;酒精計:河北天天玻璃儀表廠;RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;中空纖維膜超濾裝置:天津奧特賽恩斯儀器有限公司;氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC－MS):Agilent Technologies公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 柿子酒發(fā)酵工藝流程

柿子→挑選→去柄→打漿→添加果膠酶、亞硫酸→調(diào)整糖度、酸度→加酵母發(fā)酵→陳釀→澄清→過濾→成品。

1.3.2 柿子酒發(fā)酵工藝優(yōu)化設(shè)計

以發(fā)酵液的酒精度為評價指標，選取酵母添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始pH值及發(fā)酵初始糖度四個因素，每個因素中選三個水平進行正交試驗。正交實驗因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素水平

1.3.3 檢測方法

可溶性固形物:手持糖度儀;pH測定:pH測定儀;酒精度測定:蒸餾比重法［15］。

1.3.4 香氣成分的提取

準確量取柿子酒50 mL，放入分液漏斗中，加入30 mL二氯甲烷，振蕩、靜置分層后，分離并收集有機相;重復提取2次，合并有機相，加入適量的無水硫酸鈉脫水干燥，35℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1～2 mL，供 GC －MS 分析［16］。

1.3.5 色譜條件

非極性色譜柱(HP－5MS)(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱(美國 Agilent公司);進樣后，溶劑延遲時間4 min，程序升溫50℃，保持5 min，以 5℃/min 升至 200℃，保持 15 min，再以10℃/min升至250℃，保持5 min;進樣口溫度為250℃;傳輸線溫度250℃;載氣為 He，流速1 mL/min;分流比為50:1。電離方式EI，70 eV;離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍50～550 AMU。

2.結(jié)果與分析

2.1 柿子酒發(fā)酵最佳工藝條件的確定

以發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始PH、發(fā)酵初始糖度、酵母添加量四因素三水平進行正交試驗，以柿子酒酒精度作為評價指標，確定柿子酒最佳發(fā)酵工藝條件，試驗結(jié)果如表2、表3所示。

表2中的極差分析表明，4種因素對酒精度的影響主次順序為:A(溫度)＞C(糖度)＞B(pH值)＞D(酵母量)，即發(fā)酵的溫度值對柿子酒發(fā)酵的影響最大，且最佳的水平組合是A2B2C3D3，為了進一步驗證以上結(jié)果，按優(yōu)化設(shè)計組合進行了驗證性試驗，得到柿子酒酒精度為13.1%，大于正交試驗中各條件的結(jié)果。方差分析結(jié)果(表3)表明，A因素達到顯著水平，B、C、D未達到顯著水平，與極差分析結(jié)果一致。因此，結(jié)合方差分析和極差分析的結(jié)果，最終確定柿子酒發(fā)酵的最佳條件為A2B2C3D3，即溫度 20.5℃，pH 值 4.0，糖度 20.5%，酵母接種量0.6 g/L。

表2 L9(34)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果方差分析

2.2 柿子酒香氣成分測定結(jié)果

采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀對柿子酒進行香氣成分分析，其香氣成分總離子流色譜圖見圖1。

圖1 柿子酒中香氣成分的總離子流色譜圖

經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，得出柿子酒中各香氣成分的相對含量，如表4所示。

表4 柿子酒香氣成分的GC－MS分析結(jié)果

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結(jié)合圖1和表4可知，在48種組分中，香氣成分物質(zhì)有41種，占98.15%，主要為脂肪醇、脂肪羧酸、低級脂肪酸、芳香醇、脂肪酮、醚類、烷烴類、胺類、雜環(huán)類(噻吩類)、硫化合物等，其中醇類9種，酸類7種，酯類8種，酮類4種，醛類2種，烷烴類2種，烯烴類2種，其他類占2.071%。含量較高的有3－氯 －1.2 － 丙二醇(23.688%)、一氯戊烷(14.029%)、苯乙醇 (12.91%)、檸檬酸三乙酯 (9.038%)。醇類化合物是柿子酒中含量最大的一類物質(zhì)，占總成分42.188%，其中苯乙醇的香味獨特，具有花香、紫羅蘭香、玫瑰香、香料辛辣味、茉莉香、茴芹香、礦物味、丁香味、果味等多樣風味，它是構(gòu)成該酒主要特征香氣的組分，相對含量排在其次的化合物為酸類化合物，占總成分的20.908%，相對含量排第三的為酯類化合物，占總香氣成分的11.971%。檢測出的香氣成分中較為特殊的是2－吡咯烷酮，但目前在柿子酒香氣成分研究中尚未見報道，它具有香甜味、香草味、咖啡味、焦糖味、糖果味、蜂蜜味等。

3.結(jié)論

通過正交試驗優(yōu)化了柿子酒的發(fā)酵工藝條件，確定發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)為:葡萄酒專用酵母用量0.6g/L，發(fā)酵初始糖度 20.5%，發(fā)酵初始 pH4.0，發(fā)酵溫度20.5℃，在此條件下柿子酒的理化指標為酒精度13.1%，總糖含量 3.6g/L，總酸含量 5.21g/L。經(jīng)氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，鑒定出41種香氣成分物質(zhì)，其中醇類9種，酸類7種，酯類8種，酮類4種，醛類2種，烷烴類2種，烯烴類2種，其他類占2.071%，柿子酒的主要揮發(fā)性芳香成分是:3－氯－1.2－丙二醇、一氯戊烷、苯乙醇、檸檬酸三乙酯等。

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