黃仁發(fā)，梁群卿，黃國(guó)東，向少偉，黃海燕，胡 維，龍 韻，吳金玉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530011;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院健康體檢中心，南寧 530011;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530023)

加味六味地黃湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織Notch1/jagged-1信號(hào)通路的影響?

黃仁發(fā)1，梁群卿2，黃國(guó)東1，向少偉1，黃海燕1，胡 維1，龍 韻1，吳金玉3Δ

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530011;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院健康體檢中心，南寧 530011;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530023)

目的:觀察加味六味地黃湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎組織Notch1、jagged1蛋白表達(dá)的影響。方法:健康成年SD大鼠90只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、中藥組3組。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水(2 ml/只/d)灌胃，中藥組給予加味六味地黃湯組灌胃(2 ml/d)。HE染色和Masson染色觀察腎臟病理改變，免疫組化和Western blot觀察大鼠腎組織Notch1、jagged1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，中藥組大鼠小管間質(zhì)病變減輕。與假手術(shù)組相同時(shí)間點(diǎn)相比較，模型組大鼠小管間質(zhì)半定量評(píng)分、Notch1、jagged1蛋白表達(dá)均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)相比較，加味六味地黃湯顯著降低小管間質(zhì)半定量評(píng)分、Notch1、jagged1蛋白表達(dá)。結(jié)論:加味六味地黃湯可能通過阻斷Notch1/jagged1信號(hào)通路的活化，發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用。

單側(cè)輸尿管梗阻;腎間質(zhì)纖維化;加味六味地黃湯;Notch1/jagged1信號(hào)通路

腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是各種終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)最終的病理改變。研究證實(shí)，RIF程度比腎小球硬化與腎功能減退的相關(guān)性更為密切［1］。因此目前一致認(rèn)為，RIF是導(dǎo)致腎功能喪失最主要的病理生理過程。前期臨床研究表明，六味地黃湯及其怡腎湯(六味地黃湯加桂枝、荊芥、大黃)能改善5/6腎切除大鼠腎臟病理，減少慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者的蛋白尿，改善腎功能，降低血清纖維連接蛋白、IV型膠原纖維等致纖維因子，改善CKD患者的免疫功能，抑制微炎癥狀態(tài)［2-6］。最近我們的研究提示，Notch信號(hào)通路參與調(diào)控腎缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的炎癥和凋亡過程［7］。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)，大部分CKD患者均有疲倦乏力、水腫等脾氣虛等癥狀，因此我們?cè)阝I湯基礎(chǔ)上加黃芪，命名為加味六味地黃湯，取黃芪補(bǔ)氣健脾利水之功。本研究擬探討加味六味地黃湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎組織Notch1/jagged-1信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步明確其抗RIF的信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10～12周齡健康雄性清潔級(jí) SD(Sprasue-Dawley)大鼠，體質(zhì)量(210±34)g共90只，購自上海斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(湘)2009-0004)，在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，在室溫18～25℃、相對(duì)濕度50%～60%、人工12 h晝/夜循環(huán)照明環(huán)境中用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)、分籠飼養(yǎng)。每日定時(shí)清洗籠舍，大鼠自由攝食及飲水。

1.2 主要儀器與試劑

BX-50生物光學(xué)顯微鏡、水平電泳槽、Notch1多克隆抗體(santa cruz，sc-373891∶120kd);jagged1多克隆抗體(santa cruz，sc-16011∶150kd);SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);蛋白提取試劑盒(上海申能博彩生物技術(shù)公司);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司;PMSF (江蘇碧云天生物技術(shù)公司);PDVF膜(蘇州廣惠科技有限公司)。

1.3 加味六味地黃湯藥物組成及制備

加味六味地黃湯藥物組成:熟地黃10 g，山茱萸10 g，干山藥15 g，澤瀉10 g，茯苓12 g，丹皮10 g，大黃10 g，桂枝10 g，丹參15 g，黃芪30 g，以上藥物共132 g，均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科。將藥材用相當(dāng)于藥材5倍自來水浸泡2 h，煮沸后微火煎煮30 min，過濾、收集煎液，原藥渣加少量水煎煮后得二煎。兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮至濃度為每毫升藥液含生藥1 g。

1.4 單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型的建立

大鼠造模方法按照既往方法進(jìn)行［8］。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定，鼠背部左肋下備皮，常規(guī)消毒沿腋后線從左肋下向尾部方向剪開皮膚，鈍性分離皮下肌層和組織，暴露左腎，并沿腎蒂向腎下極方向?qū)ふ逸斈蚬?，在輸尿管上段行雙線(4號(hào)絲線)結(jié)扎，兩結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管，逐層縫合皮下組織和皮膚。假手術(shù)組除不結(jié)扎輸尿管外，其他步驟均相同。

1.5 分組與給藥

健康成年SD大鼠90只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥組3組各30例。各組組內(nèi)再隨機(jī)分為1周、2周、4周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死10只大鼠。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水(2 ml/只/d)灌胃，中藥組在造模后給予加味六味地黃湯藥液(2 ml/只/d)灌胃，留取各組大鼠左腎組織檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 腎臟病理檢測(cè) 取左側(cè)1/2腎臟置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中，將標(biāo)本按順序脫水、石蠟包埋、切片，行HE和Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎間質(zhì)的改變并攝像。按以下方法進(jìn)行評(píng)估［9］:計(jì)算30個(gè)高倍視野(×400)腎皮質(zhì)中發(fā)生損害(腎小管擴(kuò)張、萎縮、管型、壞死或小管炎)的腎小管數(shù)目和總腎小管數(shù)，以損害的腎小管數(shù)占總腎小管數(shù)的百分比表示。腎間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行半定量評(píng)估，分值為0～4分:0分為正常;1分為腎間質(zhì)纖維化面積不超過視野25%;2分為25%～49%;3分為50%～75%;4分為超過75%。計(jì)算30個(gè)腎皮質(zhì)高倍視野，求和、取平均數(shù)，得該標(biāo)本腎間質(zhì)纖維化分值。

1.6.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠腎組織Notch1、jagged1蛋白表達(dá) 切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 M枸櫞酸緩沖液煮沸修復(fù)抗原，山羊血清工作液封閉，分別滴加Notch1多克隆抗體(1∶150)、jagged1多克隆抗體(1∶150)，37℃孵育30 min，4℃過夜。DAB顯色5～20 min，顯微鏡下觀察大鼠腎組織蛋白表達(dá)量及部位，腎小管上皮細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒為陽性，不著色者為陰性。

1.6.3 western blot法檢測(cè)各組大鼠腎組織Notch1、jagged1蛋白表達(dá) 取保存的腎組織50～100 mg在冰上剪成碎片，加入蛋白裂解液提取組織總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。按Western blot步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行 Notch1多克隆抗體(1∶100)、jagged1多克隆抗體(1∶200)、β-actin多克隆抗體(1∶3000)免疫檢測(cè)，蛋白條帶用IPP圖像分析軟件檢測(cè)其OD值，用β-actin蛋白作為內(nèi)參對(duì)照，通過計(jì)算比值(OD目的蛋白/ODβ-actin)即目的蛋白表達(dá)量來分析Notch1、jagged1蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，方差齊用單因素方差分析，采用LSD多樣本均數(shù)間兩兩比較，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 加味六味地黃湯對(duì)大鼠腎臟病理的影響

圖1、2和表1顯示，假手術(shù)組大鼠腎小球及腎小管間質(zhì)基本正常。而模型組大鼠第1周開始出現(xiàn)腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化，之后病變逐漸加重，至第4周腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化達(dá)高峰。加味六味地黃湯處理可明顯改善小管萎縮、間質(zhì)纖維化等病變。半定量評(píng)分結(jié)果表明，與假手術(shù)組第1周、第2周和第4周相比較，模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組第1周、第2周和第4周比較，中藥組各相同時(shí)間點(diǎn)大鼠腎小管間質(zhì)評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠腎組織病理改變(HE×400)

圖2 各組大鼠腎組織病理改變(Masson×400)

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)半定量評(píng)分比較(n=10，±s)

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)半定量評(píng)分比較(n=10，±s)

注:與假手術(shù)組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05

組別/時(shí)間點(diǎn) 1周 2周 4周假 手 術(shù) 組0.12±0.04 0.13±0.05 0.11±0.03模 型 組 1.87±0.68＊＊ 2.62±1.12＊＊ 4.12±1.64＊＊中 藥 組 1.28±0.52△ 1.95±0.68△ 3.31±1.84△

2.1 加味六味地黃湯對(duì)大鼠腎組織Notch1、jagged-1蛋白表達(dá)的影響

圖3～5顯示，假手術(shù)組大鼠腎組織未見Notch1陽性蛋白表達(dá)，可見少量的jagged-1蛋白表達(dá)。而模型組大鼠第1周即可見到較多的Notch1、jagged-1陽性蛋白表達(dá)，隨時(shí)間推移Notch1、jagged-1陽性蛋白表達(dá)逐漸增多，至第4周Notch1、jagged-1蛋白達(dá)高峰與假手術(shù)組相同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)加味六味地黃湯治療后，腎組織第1周、第2周和第4周Notch1、jagged-1蛋白表達(dá)均下調(diào)，與模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 第2周各組大鼠腎組織Notch1蛋白表達(dá)(免疫組化×200)

圖4 第2周各組大鼠腎組織jagged1蛋白表達(dá)(免疫組化×200)

3 討論

Notch信號(hào)通路是一條進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞間信號(hào)通路，其作用廣泛，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化以及三維器官的發(fā)育等過程［10］，由一系列蛋白分子家族組成，包括Notch受體、其配體、正負(fù)修飾分子以及轉(zhuǎn)錄因子［11］。Notch信號(hào)分子具有高度保守性，但不同物種具體組成有所不同，人和老鼠均有4個(gè)Notch受體，即 Notch1-Notch4;在哺乳動(dòng)物中，Notch配體共有5種，一般與Delta同源性高的稱為Delta或Delta-like(DII)，與Serrate同源性高的稱為Jagged，分別為DII 1、3、4和Jaggedl、2［11］。

圖5 各組大鼠腎組織Notch1、jagged－1蛋白表達(dá)(western blot)

表2 各組大鼠腎組織Notch1蛋白表達(dá)(n=10，±s，OD目的/OD內(nèi)參)

表2 各組大鼠腎組織Notch1蛋白表達(dá)(n=10，±s，OD目的/OD內(nèi)參)

注:與模型組比較:△P＜0.05

組 別 1周 2周 4周假手術(shù)組0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模 型 組 0.25±0.12 0.37±0.09 0.58±0.13中 藥 組 0.13±0.08△ 0.23±0.11△ 0.36±0.99△

表3 各組大鼠腎組織jagged-1蛋白表達(dá)(n=10，±s，OD目的/OD內(nèi)參)

表3 各組大鼠腎組織jagged-1蛋白表達(dá)(n=10，±s，OD目的/OD內(nèi)參)

注:與假手術(shù)組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05

組 別 1周 2周 4周假手術(shù)組0.09±0.03 0.08±0.01 0.10±0.02模 型 組 0.34±0.11＊＊ 0.54±0.15＊＊ 0.76±0.18＊＊中 藥 組 0.19±0.10△ 0.28±0.13△ 0.45±0.07△

研究表明，在胚胎的器官發(fā)育期間，Notch信號(hào)通路保持較高的活性。然而一旦器官發(fā)育成熟，Notch信號(hào)通路活性即明顯減弱或失活［12］。已有研究表明，Notch信號(hào)通路的活化參與了各種腎臟疾病。如David W.Walsh［13］等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病時(shí)腎小管Jagged1/Notch1/HES1信號(hào)通路被激活，并可能作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(ransforming growth factor β1，TGF-β1)的下游信號(hào)通路，與Gremlin共同參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。Morrissey等學(xué)者應(yīng)用基因芯片篩選研究發(fā)現(xiàn)［14］，單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型的遠(yuǎn)端腎小管Notch1、3、4和jagged-1、2的基因表達(dá)均增加，TGF-β1可誘導(dǎo)人類腎小管上皮細(xì)胞的jagged-1表達(dá)，提示UUO大鼠模型存在TGF-β1依賴的Notch信號(hào)通路激活。JiriZavadil等學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)［15］，Notch/Jaggedl信號(hào)通路激活可調(diào)控 TGF-β1誘發(fā)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)。因此，探討Notch信號(hào)通路活化在RIF過程中具有重要的意義。

本研究結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠腎組織未見Notch1陽性蛋白表達(dá)，可見少量的jagged-1蛋白表達(dá)，這與以往的研究相一致［7］。而模型組大鼠第1周即可見到腎小管萎縮及RIF，至第4周則上述改變逐漸加重，而同樣從大鼠第1周即可見較多Notch1、jagged-1陽性蛋白表達(dá)。隨時(shí)間推移Notch1、jagged-1陽性蛋白表達(dá)逐漸增多，至第4周Notch1、jagged-1蛋白達(dá)高峰，這與腎臟病理的高峰期相一致，提示UUO大鼠腎組織重新活化Notch1/ jagged-1信號(hào)通路可能參與了RIF過程。進(jìn)一步的研究表明，加味六味地黃湯可以改善RIF病理改變，而且可以抑制腎組織Notch1、jagged-1蛋白表達(dá)，提示加味六味地黃湯可能通過阻斷 Notch1/jagged-1信號(hào)通路的活化抑制RIF過程。但加味六味地黃湯是否還能通過抑制其他信號(hào)通路發(fā)揮抗腎纖維化作用，尚需進(jìn)一步研究。

［1］Kalluri R.EMT:when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells［J］.J Clin Invest，2009，119(6):1417-1419.

［2］陳北陽，何澤云，龍若庭，等.怡腎湯對(duì)大鼠5/6腎切除術(shù)后殘腎腎功能及組織形態(tài)學(xué)的影響［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25(3):11-13.

［3］黃仁發(fā)，史偉，吳金玉.怡腎湯治療慢性腎衰竭的療效觀察及對(duì)免疫功能的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27 (6):52-54.

［4］黃仁發(fā)，隆獻(xiàn)，吳金玉.怡腎湯對(duì)3～4期CKD患者血清LN、CV-Ⅳ和SOD、MDA的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2009，10(5):421-422.

［5］康雷，黃仁發(fā)，向少偉.加味六味地黃湯對(duì)3～4期慢性腎臟病患者微炎癥狀態(tài)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10(12):1354-1359

［6］何澤云.六味地黃丸對(duì)5/6腎切除大鼠殘腎腎小球化生的影響［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24(2):1-3.

［7］Huang R，Zhou Q L，Veeraragoo P，et al.Notch2/Hes-1 Pathway Plays an ImportantRolein RenalIschemiaand Reperfusion Injury-Associated Inflammation and Apoptosis and the g-Secretase Inhibitor DAPT has a Nephroprotective Effect［J］.Renal Failure，2011，2(3):207-216.

［8］黃仁發(fā)，林心如，梁群卿，等.加味六味地黃湯對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織CTGF和MMP-2的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2015，16(3):196-199.

［9］黃仁發(fā)，梁群卿，吳金玉，等.加味六味地黃湯對(duì)UUO大鼠腎組織TGF-β1及EMT的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，10(12):737-751.

［10］Brent McCright.Notch signaling in kidney development［J］. Current Opinion in Nephrology and Hypertension，2003，12:5-10.

［11］Kopan R，Ilagan MX.The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism［J］.Cell，2009，137:216-233.

［12］Schweisguth F.Notch signaling activity［J］.Curr Biol，2004，14:129-138.

［13］David W.Walsh et al.Co-regulation of Gremlin and Notch signalling in diabetic nephropathy ［J］. Biochimica et Biophysica，2008，178210-1782221.

［14］Morrissey J，Guo G，Moridaira K，et al.Transforming growth factor-beta induce renal epithelial Jagged1 expression in fibrotic disease［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13:1499-1508.

［15］Jiri Zavadil，Lukas Cermak，Noemi Soto-Nieves.Integration of TGF-b/Smad and Jagged1/Notch signalling in epithelial-tomesenchymal transition［J］.The EMBO Journal，2004，23:1155-1165.

Effects of Modified Liuwei Dihuang Decoction on the Notch1/jagged1 Pathway in the Rat’s Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

HUANG Ren-fa1，LIANG Qun-qing2，HUANG Guo-dong1，XIANG Shao-wei1，HUANG Hai-yan1，HU Wei1，LONG Yun，WU Jin-yu3△
(1．Nephrology department，the affiliated RuiKang Hospital of GuangXi University of traditional Chinese medicine，Nanning 530011，China;2．Health care central，the affiliated RuiKang Hospital of GuangXi University of traditional Chinese medicine，Nanning 530011，China;3．Nephrology department，the first affiliated Hospital of GuangXi University of traditional Chinese medicine，Nanning 530023，China)

Objective:To observe the effect of Modified Liuwei Dihuang decoction on the Notch1/jagged1 pathway in the rat’s kidney with Unilateral ureteral obstruction(UUO).Method:The 90 rats were individed into 3 groups randomly: sham group，Model group and Chinese medicine group.The rats both in the sham group and Model group were treated by intragastric administration of physiological saline，and the rats in the Chinese medicine group were treated by intragastric administration of Modified Liuwei Dihuang decoction.And the kidney pathology by HE and Masson stain，and the protein expression of Notch1，jagged1 in the kidney were detected by the way of immunohistochemistry and western blot.Result The kidney structure in the sham group is regular.And the renal interstitial fibrosis in the Model group rats is found. However，the kidney pathology is improved in the Chinese medicine group.Our results indicated that，the semi-quantitative scores，the protein expression of Notch1，jagged1 in the Model group are higher than those in the sham group.However，the Modified Liuwei Dihuang decoction treatment could reduce index including the semi-quantitative scores，the protein expression of Notch1，jagged1.Conclusion:Modified Liuwei Dihuang decoction could provide an anti-Renal interstitial fibrosis role by blocking the activation of Notch1/jagged1 pathway.

Unilateral ureteral obstruction;Renal interstitial fibrosis;Modified Liuwei Dihuang decoction;Notch1/ jagged1 pathway

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1401-03

2015-04-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81060292);廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFAA118217);廣西教育廳重點(diǎn)課題(201202ZD052);廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)課題(重2012029)

△通訊作者:吳金玉，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，Tel:0771-5855356，E-mail:wujinyu0109@sina.com。