陳 燕，陳明衛(wèi)△，方朝暉，夏同佳，童俊露，王佑民

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230032; 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230031)

丹蛭降糖膠囊對(duì)高脂飼養(yǎng)大鼠骨骼肌脂聯(lián)素蛋白構(gòu)成的影響?

陳 燕1，陳明衛(wèi)1△，方朝暉2，夏同佳1，童俊露1，王佑民1

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230032; 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230031)

目的:觀察丹蛭降糖膠囊對(duì)肥胖大鼠骨骼肌脂聯(lián)素(APN)蛋白多聚體構(gòu)成的影響。方法:SD大鼠隨機(jī)分為普通對(duì)照組(NC組)、高脂對(duì)照組(HF組)、低劑量丹蛭降糖膠囊組(FD1組)和高劑量丹蛭降糖膠囊組(FD2組)。檢測(cè)血清總APN、高分子量APN(HMW APN)以及骨骼肌組織中各聚合態(tài)APN蛋白表達(dá)。結(jié)果:HF組大鼠血清以及骨骼肌HMW APN均低于NC組，F(xiàn)D1組、FD2組大鼠骨骼肌HMW APN表達(dá)高于HF組，F(xiàn)D2組大鼠骨骼肌HMW APN表達(dá)顯著高于FD1組。結(jié)論:丹蛭降糖膠囊能提高骨骼肌中HMW APN蛋白水平，具有劑量依賴效應(yīng)。

肥胖;骨骼肌;脂聯(lián)素;大鼠;丹蛭降糖膠囊

脂聯(lián)素(APN)是脂肪組織分泌性蛋白，與肥胖密切相關(guān)［1］。近年來(lái)研究表明，APN也可在骨骼肌組織中表達(dá)分泌。這種骨骼肌源性APN同樣具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗(IR)、促進(jìn)脂肪酸氧化的效應(yīng)［2-3］。丹蛭降糖膠囊是由太子參、丹皮、生地黃、澤瀉、菟絲子、水蛭組成的復(fù)方制劑。研究發(fā)現(xiàn)，它可提高肥胖模型大鼠骨骼肌IR，具體機(jī)制目前尚不完全清楚［4-5］。本研究通過(guò)高脂喂飼建立肥胖大鼠模型，使用丹蛭降糖膠囊進(jìn)行干預(yù)，觀察骨骼肌組織中APN蛋白多聚體構(gòu)成的變化，初步探討丹蛭降糖膠囊改善骨骼肌IR的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)及分組

清潔級(jí)4周齡70只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(150 ±30)g，購(gòu)自安立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司(動(dòng)物合格證號(hào)4322)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)挑選15只大鼠作為普通飲食對(duì)照組(NC組)，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余55只給予高脂飼料喂養(yǎng)，作為高脂飲食組(HD組)。12周后以HD組大鼠體質(zhì)量超過(guò)NC組大鼠平均體質(zhì)量20%為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定肥胖大鼠造模成功。45只符合肥胖模型的大鼠按體質(zhì)量再隨機(jī)分為高脂對(duì)照組(HF組)、高脂+低劑量丹蛭降糖膠囊組(FD1組)、高脂+高劑量丹蛭降糖膠囊組(FD2組)各15只，繼續(xù)高脂飲食，同時(shí)每組分別給予溶媒2 ml ·kg-1·d-1、丹蛭降糖膠囊470 mg·kg-1·d-1、丹蛭降糖膠囊940 mg·kg-1·d-1灌胃。NC組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，給予蒸餾水灌胃，持續(xù)治療時(shí)間4周。

1.2 主要儀器和試劑

MODULE P800型全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司)、水平電泳槽、兔抗鼠APN單克隆一抗(美國(guó)Millipore公司，克隆號(hào)為AD1773，Uniprot編號(hào)為Q15848，Entrez基因編號(hào)為NM_004797.2)、山羊抗兔多克隆二抗(江蘇碧云天生物科技公司，批號(hào)A0562)、蛋白提取試劑盒(上海申能博彩生物技術(shù)公司)、BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)、PDVF膜(蘇州廣惠科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本收集 16周時(shí)4組大鼠禁食過(guò)夜8h后，以10%水合氯醛麻醉，麻醉狀態(tài)下準(zhǔn)確稱取體質(zhì)量，下腔靜脈取血分離血清，-80℃冰箱中以備各項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定;迅速分離大鼠股四頭肌組織，置于液氮罐中保存以備提取TG。

1.3.2 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀及配套試紙檢測(cè)空腹血糖(FBG)，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)，放射免疫法檢測(cè)空腹血清胰島素(FINS，美國(guó)Linco公司)，銅顯色法測(cè)定血游離脂肪酸(FFA，江蘇南京建成生物公司)。

1.3.3 大鼠血清APN測(cè)定 4組大鼠禁食過(guò)夜8 h后，以10%水合氯醛麻醉下腔靜脈取血、分離血清。采用大鼠血清APN雙抗體夾心法ELISA試劑盒(美國(guó)R＆D公司)測(cè)定血總APN、高分子量脂聯(lián)素(HMW APN)以及低分子量脂聯(lián)素(LMW APN)。主要步驟:設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，其中標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，樣本孔加待測(cè)樣本10 μl，再加入稀釋液40 μl。隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔中和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，恒溫箱溫育60 min后應(yīng)用洗板機(jī)洗板干燥。每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min，每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本總APN、HMW APN以及LMW APN濃度值(μg/ml)。并根據(jù)ELISA法測(cè)得結(jié)果計(jì)算血清中HMW比例=血HMW APN(μg/ ml)/血總APN(μg/ml)。

1.3.4 大鼠骨骼肌組織APN蛋白測(cè)定 取100 mg股四頭肌組織剪碎，加入1 ml組織裂解液置于冰上，玻璃勻漿器勻漿，4℃ 12000 rpm×10 min離心，按BCA法測(cè)定蛋白濃度。取骨骼肌組織蛋白與非還原非變性加樣緩沖液(江蘇碧云天生物科技公司)混勻于4℃進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入兔抗鼠APN一抗(1∶300)孵育過(guò)夜。第2天加入山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(二抗試劑，1∶5000)孵育2 h，ECL顯影，使用Band Scan 5.0軟件分析條帶灰度，骨骼肌中各聚合態(tài)APN蛋白表達(dá)水平以各聚合態(tài)APN/GAPDH灰度值表示。骨骼肌中HMW比例=HMW/(HMW+LMW)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、代謝指標(biāo)變化

表1顯示，HF組的體質(zhì)量、FBG、FINS、TG、TC、FFA均高于NC組(P＜0.05～0.01)。FD1組、FD2組體質(zhì)量、FBG、FINS、TG、TC、FFA均較HF組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 各組大鼠血清總APN、HMW APN、LMW APN水平以及HMW比例的比較

表2顯示，與NC組比較，HF組大鼠血清總APN、HMW APN水平以及HMW比例均明顯降低(P＜0.05);HF組、FD1組、FD2組3組間大鼠血清總APN、HMW APN水平以及HMW比例均無(wú)顯著變化(P＞0.05)，4組間LMW APN水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、代謝指標(biāo)的比較(±s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、代謝指標(biāo)的比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 體質(zhì)量(g) FBG(mmol/L) FINS(mIU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) FFA(μmol/L) NC組 15 353.36±42.26 5.11±0.87 11.96±4.16 0.47±0.74 1.43±0.31 327.24±38.31 HF組 15 460.48±53.58＊＊ 6.75±1.99＊＊ 35.12±12.27＊＊ 0.98±0.62＊＊ 1.88±0.34* 475.42±40.18＊＊FD1組 15 457.22±48.91 6.52±1.66 27.96±11.08 0.93±0.69 1.79±0.31 457.83±40.28 FD2組 15 450.13±49.31 6.37±1.71 25.17±10.04 0.90±0.68 1.76±0.32 447.65±43.82

圖1 Western blot檢測(cè)大鼠骨骼肌APN多聚體構(gòu)成

2.3 各組大鼠骨骼肌組織HMW APN、LMW APN水平以及HMW比例的比較

表3顯示，非還原非加熱變性的SDS-PAGE檢測(cè)到3條APN蛋白條帶，～130 kDa條帶代表相對(duì)低分子量六聚體LMW APN，～250 kDa和＞300 kDa條帶代表高分子量高聚體HMW APN(圖1)。與NC組比較，HF組大鼠骨骼肌HMW APN表達(dá)以及HMW比例均明顯降低(P＜0.05～0.01);與HF組比較，F(xiàn)D1組、FD2組大鼠骨骼肌HMW APN表達(dá)以及HMW比例均顯著增加(P＜0.05);與FD1組比較，F(xiàn)D2組大鼠骨骼肌HMW APN表達(dá)以及HMW比例均顯著增加(P＜0.05)，4組間LMW APN水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠血清APN水平的比較(±s)

表2 各組大鼠血清APN水平的比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 總APN (μg/ml) HMW APN (μg/ml) LMW APN (μg/ml) HMW/總APN NC組15 4.01±0.13 2.03±0.15 0.73±0.12 0.50±0.06 HF組 15 1.98±0.14* 0.88±0.16* 0.75±0.10 0.44±0.05*FD1組 15 2.15±0.14 1.06±0.18 0.73±0.11 0.46±0.07 FD2組15 2.18±0.15 1.12±0.18 0.73±0.13 0.48±0.06

表3 各組大鼠骨骼肌組織APN蛋白表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠骨骼肌組織APN蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 HF組比較:△P＜0.05;與FD1組比較:☆P＜0.05

APN 組 別 鼠數(shù) HMW APN LMW APN HMW/總NC組15 1.19±0.14 0.69±0.12 0.69±0.06 HF組 15 0.66±0.15＊＊ 0.62±0.11 0.45±0.05*FD1組 15 0.89±0.14△ 0.63±0.12 0.54±0.06△FD2組 15 1.03±0.13△☆ 0.64±0.13 0.63±0.07△☆

3 討論

目前已證實(shí)，APN具有減輕IR、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎作用，其部分生物活性依賴于其自身的多聚體化過(guò)程。APN可以通過(guò)3個(gè)球形結(jié)構(gòu)域?qū)误w連接成三聚體，2～6個(gè)三聚體通過(guò)膠原結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步連接成LMW APN或者HMW APN的高級(jí)結(jié)構(gòu)。血漿中APN以多種聚合態(tài)存在，主要為低聚態(tài)和高聚態(tài)。研究表明，HMW APN是APN作用的主要活性形式，對(duì)改善胰島素敏感性更重要。有研究發(fā)現(xiàn)，基因部分位點(diǎn)突變會(huì)影響APN合成分泌多聚化過(guò)程，從而影響HMW APN含量及其比例，導(dǎo)致APN生物活性受損［6］。

高脂誘導(dǎo)的SD肥胖大鼠與人類肥胖的發(fā)生過(guò)程和表現(xiàn)非常相似，是較理想的營(yíng)養(yǎng)性肥胖研究模型。本研究發(fā)現(xiàn)，與普通飲食組大鼠比較，高脂對(duì)照組肥胖大鼠的內(nèi)臟脂肪明顯增加，糖脂代謝紊亂更加明顯，IR程度加重，同時(shí)血清總APN、HMW APN、HMW比例均有一定程度下降，整體上呈抑制狀態(tài)，與先前的研究發(fā)現(xiàn)一致［7-8］。有研究已證實(shí)，高脂高熱卡誘導(dǎo)的肥胖可對(duì)皮下以及內(nèi)臟脂肪組織中APN多聚化過(guò)程造成影響［6］，但是否會(huì)影響骨骼肌中APN多聚化過(guò)程尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與普通飲食對(duì)照組大鼠比較，高脂對(duì)照組大鼠骨骼肌中HMW APN表達(dá)以及HMW比例均顯著降低，表明高脂誘導(dǎo)的肥胖可對(duì)骨骼肌組織中APN多聚化過(guò)程造成影響，從而參與骨骼肌IR的發(fā)生發(fā)展。

丹蛭降糖膠囊是由太子參、丹皮、生地黃、澤瀉、菟絲子、水蛭組成的復(fù)方制劑，已于2006年獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)［9］。研究表明，它具有改善糖脂代謝以及IR等功效［4，10］，但其具體機(jī)制尚不明確。有研究報(bào)道，丹蛭降糖膠囊對(duì)2型糖尿病IR大鼠血漿APN水平的改變具有劑量依賴效應(yīng)，丹蛭降糖膠囊高劑量組較低劑量組升高血漿APN水平更高［11］。故本研究選擇高、低劑量組的丹蛭降糖膠囊進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論低劑量組(FD1組)還是高劑量組(FD2組)，應(yīng)用丹蛭降糖膠囊干預(yù)后，肥胖大鼠血總APN及HMW比例無(wú)顯著影響，與先前在2型糖尿病肥胖大鼠中的發(fā)現(xiàn)不一致［11］，原因尚不清楚，推測(cè)可能與2組研究中實(shí)驗(yàn)大鼠肥胖程度、糖脂代謝紊亂程度等因素差異有關(guān)。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是FD1組還是 FD2組，大鼠骨骼肌中HMW APN與HMW比例均有顯著提高，表明在肥胖大鼠骨骼肌中HMW APN的合成分泌水平會(huì)受丹蛭降糖膠囊影響而上調(diào)，提示丹蛭降糖膠囊可能通過(guò)影響肥胖大鼠骨骼肌中APN多聚化過(guò)程，從而改善骨骼肌IR。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，高劑量組中大鼠骨骼肌中HMW APN表達(dá)以及HMW比例的提高均顯著高于低劑量組，表明丹蛭降糖膠囊對(duì)肥胖大鼠骨骼肌APN多聚化的改變具有劑量依賴效應(yīng)。本研究結(jié)果將為揭示丹蛭降糖膠囊改善骨骼肌IR提供一個(gè)新的機(jī)制認(rèn)識(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)丹蛭降糖膠囊可促進(jìn)肥胖大鼠骨骼肌中HMW APN的合成分泌，提高HMW比例，這種效應(yīng)具有劑量依賴效應(yīng)。

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Effects of Danzhi Jiangtang Capsule on Adiponectin Composition in Skeletal Muscle in Obese Rats Fed with High-fat Diet

CHEN Yan1，CHEN Ming-wei1△，F(xiàn)ANG Zhao-hui2，XIA Tong-jia1，TONG Jun-lu1，WANG You-min1
(1．Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2．Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM，Hefei 230031，China)

Objective:To investigate the effect of Danzhi Jiangtang Capsule on adiponectin compostion in skeletal muscle in high-fat diet(HFD)SD rats.Methods:Rats were randomly divided into 4 groups(n=15):chow diet rats as NC group，HFD rats treated with vehicle，low-dose Danzhi Jiangtang Capsule(470 mg·kg-1·d-1)and high-dose Danzhi Jiangtang Capsule(940 mg·kg-1·d-1)as HF，F(xiàn)D1 group and FD2 group，respectively.Serum total adiponectin and high molecular weight adiponectin were detected by ELISA，respectively.Adiponectin oligomer compostion in skeletal muscle were separated by Western blot under non-heat-denatured and non-reduced conditions.Results:In HF group，either in serum or in skeletal muscle，high molecular weight adiponectin，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin were all significantly reduced as compared with NC group.Compared with HF group，both low-dose Danzhi Jiangtang Capsule and high-dose Danzhi Jiangtang Capsule showed a significant increase of high molecular weight adiponectin，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin in skeletal muscle.Moreover，high molecular weight adiponectin expression，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin in skeletal muscle in FD2 group were significantly higher than those in FD1 group.Conclusions:Danzhi Jiangtang Capsule could enhance high molecular weight adiponectin level in skeletal muscle in a dose-independent manner.

Obese;Skeletal muscle;Adiponectin;Rats;Danzhi Jiangtang

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1447-03

2015-04-07

國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地專項(xiàng)課題(JDZX2012005)-肌源性脂聯(lián)素在高脂誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素抵抗中的作用以及丹蛭降糖膠囊的干預(yù)研究

陳 燕(1987-)，女，安徽蕪湖人，主治醫(yī)師，在讀碩士，從事肥胖發(fā)病機(jī)制的臨床與研究。

△通訊作者:陳明衛(wèi)(1968-)，男，安徽肥東人，主任醫(yī)師，從事肥胖發(fā)病機(jī)制的臨床與研究，Tel:0551-62922069。