潘 秋，趙慧輝，陳建新，董 芳，王 偉△

(1.北京市門頭溝區(qū)中醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 102300;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029;3.首都師范大學(xué)分析測(cè)試中心，北京 100037)

采用高脂飼料疊加腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)制備的糖尿病大鼠模型在糖尿病研究中應(yīng)用廣泛。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，該模型具備中醫(yī)證候?qū)傩?，屬于“脾氣虧虛、痰瘀互阻”證范疇[1-2]。文獻(xiàn)研究結(jié)果亦證實(shí)，此證候在臨床實(shí)際中出現(xiàn)頻率較高[3]，因此此種造模方法復(fù)制的糖尿病模型符合中醫(yī)藥研究需求。筆者以導(dǎo)師臨床經(jīng)驗(yàn)為指導(dǎo)思想，以具有活血化痰功效的復(fù)方(蒼術(shù)、白術(shù)、黃芩、丹參)反證糖尿病大鼠模型的證候?qū)傩?，并借助高通量組學(xué)技術(shù)，旨在闡釋中醫(yī)證候的生物學(xué)特點(diǎn)和復(fù)雜中醫(yī)藥干預(yù)手段的多靶點(diǎn)效應(yīng)。代謝組學(xué)是目前新興的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)之一，其與中醫(yī)學(xué)有著異曲同工之妙，因此筆者擬采用代謝組學(xué)技術(shù)，從微觀角度動(dòng)態(tài)揭示中藥復(fù)方療效的生物學(xué)特征，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)等技術(shù)建立動(dòng)態(tài)的大鼠尿液“代謝指紋圖譜”，通過數(shù)據(jù)分析最終找出特征性的代謝產(chǎn)物群，確定“中醫(yī)證候療效相關(guān)代謝譜”。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性8周齡SD大鼠80只，體質(zhì)量(220±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(京)2002-0003)。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物室，室溫18～25℃，相對(duì)濕度50% ～60%，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 飼料

普通飼料及高脂飼料購于中國科學(xué)院動(dòng)物所。高脂飼料配方(按質(zhì)量比):20%豬油，10%蔗糖，23%酪蛋白，0.3%蛋氨酸，28%淀粉，10%糊精，7.5%纖維素，0.3%膽堿，0.1%多維預(yù)混料，0.8%多礦預(yù)混料[4]。

1.3 藥物

活血化痰方由蒼術(shù)、白術(shù)、黃芩、丹參等按比例組成，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，采用水提法制成1 g/ml水溶液，中藥組大鼠每日8時(shí)灌胃，藥液于4℃冰箱保存;西藥組大鼠給予馬來酸羅格列酮片，購自葛蘭素史克公司，制成0.2 mg/ml水溶液，每日同時(shí)間灌胃。

1.4 試劑

STZ(批號(hào)S0130)，購自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司;乙腈(A996-4)，F(xiàn)isher Scientific;吡啶(110-86-1)，MREDA TECHNOLOGY INC;三氯甲烷(67-66-3)，MREDA TECHNOLOGY INC;17碳脂肪酸(H3500-5G)、TMCS(386529-100 ml)、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺(394866 10×1 ml)，均為美國Sigma試劑公司提供。

1.5 儀器

美國Finnigan Trace 2000/Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有RTx-5毛細(xì)管柱、Xcalibur工作站、NIST譜庫;氮?dú)獯蹈蓹C(jī)。

1.6 方法

1.6.1 造模方法 模型組高脂飲食喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ 35 mg/kg，對(duì)照組普通飲食喂養(yǎng)6周后，腹腔注射同等劑量0.1 M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，注射STZ 4周后2組大鼠尾靜脈采血檢測(cè)血糖，凡血糖值符合空腹血糖≥11.1 mmol/l者納入實(shí)驗(yàn)[5]。

1.6.2 分組 按血糖水平將大鼠從輕到重依次編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表選擇一行數(shù)字，每3只大鼠同時(shí)分組，規(guī)定根據(jù)隨機(jī)數(shù)字由小到大分別進(jìn)入中藥組、西藥組、模型組。中藥組每只大鼠分別灌胃4 ml，西藥組每只大鼠灌胃馬來酸羅格列酮1 ml，模型組和對(duì)照組均灌服制水，每日8∶00給予灌胃，連續(xù)灌胃6周。

1.6.3 血糖、血脂測(cè)定 實(shí)驗(yàn)6周過程中每周測(cè)定OGTT30 min血糖，出現(xiàn)血糖恢復(fù)的大鼠則給予剔除;血脂檢測(cè)交由東直門醫(yī)院檢驗(yàn)科。

1.6.4 尿樣留取 藥物干預(yù)第3周末及第6周末分別利用代謝籠留取中藥組、模型組、對(duì)照組大鼠24 h尿液，每組隨機(jī)選取8只，每只大鼠留取尿液1ml，分別保存于不同的試管中，檢測(cè)前保存于－80℃冰箱。

1.6.5 GC-MS樣本預(yù)處理 600 μL尿液，加入10 μL內(nèi)標(biāo)(17碳脂肪酸6 mg/ml)，加入400 μL乙腈，渦旋混合1 min，冰浴超聲10 min，18000 r/min，4℃離心5 min，取上清干凈試管中，氮?dú)獯蹈?。加?0 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/ml)混勻，30℃肟化2 h。加衍生化試劑(MST-FA:TMCS=100∶1，v/v)50 μL，混勻靜置。1 h后移取上清液到微量進(jìn)樣管，供 GC-MS 分析[6]。

1.6.6 GC-MS分析條件 氣相條件:分流比，1∶1.進(jìn)樣量 0.5 μL。進(jìn)樣口溫度 280℃，接口溫度250℃;升溫程序80℃;保持2 min，以每分鐘10℃升至140℃，以每分鐘 4℃升至240℃，再以每分鐘10℃升至280℃，保持3 min。離子源溫度200℃，載氣高純度氦氣。質(zhì)譜條件:載氣流速，1.0 ml/min;電離方式EI;電子能量70 eV，掃描范圍50～800 m/z[7]。

1.6.7 總離子流圖分析 物質(zhì)鑒定采用質(zhì)譜自帶軟件;GC-MS總離子流圖中各峰的保留時(shí)間挑選共有峰，獲取各峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積數(shù)據(jù)，用相對(duì)峰面積(與內(nèi)標(biāo)峰的比值)表示代謝物的含量。

1.6.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)GC-MS總離子流圖中各峰的保留時(shí)間挑選共有峰，獲取各峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積數(shù)據(jù)，用相對(duì)峰面積(與內(nèi)標(biāo)峰的比值)表示代謝物的含量[8]。各組模式識(shí)別采用主成分分析(PCA)，應(yīng) 用 SIMCA-P+軟 件 (V12.0.1，Umetrics，Sweden)。

2 結(jié)果

2.1 血糖水平

表1顯示，39只大鼠造模成功，18只大鼠血糖恢復(fù)給予剔除，3只大鼠死亡。西藥組灌胃4周后血糖水平出現(xiàn)下降(P＜0.05)。同樣在隨后第5～6周血糖水平持續(xù)處于低位水平;模型組大鼠灌服制水，血糖水平前后6周始終保持穩(wěn)定(P＞0.05)。

表1 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)30 min血糖(mmol/L)

2.2 血脂水平

表2顯示，與模型組比較，中藥組灌胃6周后大鼠的膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平明顯低于模型組(P＜0.05);西藥組灌服6周后大鼠的膽固醇水平低于模型組(P＜0.05);與西藥組比較，中藥組低密度脂蛋白水平優(yōu)于西藥組(P＜0.05)，其余指標(biāo)水平相當(dāng)(P＞0.05)。

2.3 總離子流圖

圖1～8顯示，第3周和第6周中藥組、西藥組、模型組和對(duì)照組總離子流圖。

2.3.1 第3周總離子流圖

2.3.2 第6周總離子流圖

表2 4組大鼠CHO TG HDL LDL水平比較

圖1 中藥組總離子流圖

圖2 西藥組總離子流圖

圖3 模型組總離子流圖

圖4 對(duì)照組總離子流圖

圖5 中藥組總離子流圖

圖6 西藥組總離子流圖

圖7 模型組總離子流圖

圖8 對(duì)照組總離子流圖

圖9 模型組前后比較尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA得分圖

2.4 代謝物鑒定

表3顯示，共有峰挑選后發(fā)現(xiàn)尿液中共有內(nèi)源性代謝物9種。利用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)共有的內(nèi)源性代謝物作鑒定，按通常匹配度大于80%的鑒定結(jié)果作為可信度較大的物質(zhì)。按保留時(shí)間分別為丙氨酸、戊二酸、L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、棕櫚酸、十八烷酸、單甘油。

表3 GC-MS尿液代謝物鑒定

2.5 GC-MS圖譜模式識(shí)別分析

2.5.1 模型組前后比較 模型組前后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t1軸分開，PCA前2個(gè)主成分累積得分為67.2%，疊加后續(xù)2個(gè)主成分，共計(jì)4個(gè)主成分累積得分85.7%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個(gè)主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個(gè)區(qū)域，第6周樣本分布于右方，第3周樣本分布于左方(結(jié)果見圖 9、10)。

2.5.2 同一時(shí)間點(diǎn)模型組、對(duì)照組比較 ①第3周模型組、對(duì)照組互相比較:模型組、對(duì)照組PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t2軸分開，PCA前2個(gè)主成分累積得分為67.4%，疊加第3個(gè)主成分，共計(jì)3個(gè)主成分累積得分84.2%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個(gè)主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個(gè)區(qū)域，對(duì)照組樣本分布于上方，模型組樣本分布于下方(結(jié)果見圖11、12)。②第6周模型組、對(duì)照組互相比較:模型組、對(duì)照組PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t1軸分開，PCA前2個(gè)主成分累積得分為53.3%，疊加后續(xù)3個(gè)主成分，共計(jì)5個(gè)主成分累積得分85.8%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個(gè)主成分得分圖中可見，各樣品分布于得分圖的2個(gè)區(qū)域，對(duì)照組樣本分布于左方，模型組樣本分布于右方(結(jié)果見圖13、14)。

圖10 模型組前后比較尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA載荷圖

圖11 第3周模型組、對(duì)照組尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA得分圖

圖12 第3周模型組、對(duì)照組尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA載荷圖

圖13 第6周模型組、對(duì)照組尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA得分圖

圖14 第6周模型組、對(duì)照組尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA載荷圖

圖15 中藥組前后比較尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA得分圖

圖16 中藥組前后比較尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA載荷圖

圖17 西藥組前后比較尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA得分圖

圖18 西藥組前后比較尿液TIC譜圖數(shù)據(jù)PCA載荷圖

2.5.3 中藥組前后比較 中藥組前后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t2軸分開，PCA前2個(gè)主成分累積得分49.0%，疊加后續(xù)3個(gè)主成分，共計(jì)5個(gè)主成分累積得分86.9%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個(gè)主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個(gè)區(qū)域，第6周樣本分布于下方，第3周分布于上方(結(jié)果見圖15、16)。

2.5.4 西藥組前后比較 西藥組前后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)PCA得分圖和載荷圖結(jié)果表明，2組基本可以沿t1軸分開，PCA前2個(gè)主成分累積得分72.5%，疊加第3個(gè)主成分，共計(jì)3個(gè)主成分累積得分87.2%，可覆蓋大部分代謝物信息。在前2個(gè)主成分得分圖中可見各樣品分布于得分圖的2個(gè)區(qū)域，第6周本分布于右方，第3周布于左方(結(jié)果見圖17、圖18)。

2.6 代謝物組內(nèi)及組間比較結(jié)果

2.6.1 組間比較 第3周根據(jù)主成分分析結(jié)果，各組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第6周與對(duì)照組比較，模型組L-抗壞血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、丙氨酸、戊二酸、十八烷酸含量增加(P＜0.05或P＜0.01)(結(jié)果見表3)。

2.6.2 組內(nèi)比較 第6周中藥組L-抗壞血酸(29 min)含量減少(P＜0.05);第6周模型組L-抗壞血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量增加(P＜0.05或P＜0.01)(結(jié)果見表4)。

3 討論

3.1 尿液代謝物濃度的變化

筆者以往實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病大鼠前3周證候?qū)傩砸云馓澨撟C為主，后3周證候?qū)傩砸蕴叼龌プ枳C為主。尿液代謝物鑒定結(jié)果顯示，與第3周比較，第6周模型組大鼠尿液中L-抗壞血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量均明顯增加。L-抗壞血酸含量增高可能是大鼠發(fā)生糖尿病后體內(nèi)氧化水平激增，機(jī)體通過自身調(diào)節(jié)而出現(xiàn)的抗氧化反應(yīng);十八烷酸是硬脂酸，屬于高級(jí)飽和脂肪酸，存在于部分植物性油脂和動(dòng)物性油脂中，飽和脂肪酸的增加可能會(huì)引起血液中膽固醇含量上升，并促使機(jī)體對(duì)胰島素等激素產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致血糖升高等代謝紊亂情況出現(xiàn)。查閱KEGG檢索丙氨酸與相關(guān)疾病的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，丙氨酸異常多見于代謝異常性疾病，這可為今后實(shí)驗(yàn)提供繼續(xù)研究的靶點(diǎn)。綜上所述，幾種代謝物的組合規(guī)律及其含量的變化基本可以闡釋大鼠中醫(yī)證候的相關(guān)代謝物特征。

表4 GC-MS大鼠尿液代謝物組內(nèi)及組間比較(例)

3.2 活血化痰方的藥效機(jī)制

尿液代謝物鑒定結(jié)果顯示，與第3周比較，第6周中藥組大鼠尿液中L-抗壞血酸含量減少，可能是中藥復(fù)方減輕糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用，因而L-抗壞血酸含量反應(yīng)性下降。同時(shí)，第6周中藥組大鼠尿液出現(xiàn)部分代謝物消失，包括丙氨酸、棕櫚酸、十八烷酸和單甘油，并出現(xiàn)了新的代謝物如L-抗壞血酸等物質(zhì)，可能是中藥復(fù)方增強(qiáng)了抗氧化作用;此外，硬脂酸和軟脂酸含量減少，提示中藥具有改善血脂代謝的作用，可能是通過改善血脂代謝進(jìn)而影響了血糖水平，或者是通過減輕胰島素抵抗的間接作用而改善高血糖狀態(tài);丙氨酸水平的下降，從一定程度上說明中藥影響了部分氨基酸代謝通路，改善了代謝紊亂狀態(tài)。

3.3 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)主要應(yīng)用在植物代謝組學(xué)研究中，分析時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理以增加樣品的穩(wěn)定性和揮發(fā)性，利于用GC-MS中的氣相色譜儀進(jìn)行分離。因此，GC-MS限于分析揮發(fā)性物質(zhì)，無法分析膜脂等熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)和分子量較大的代謝產(chǎn)物。筆者以糖尿病病證結(jié)合大鼠的尿液為樣本，根據(jù)不同組別、不同代謝產(chǎn)物含量變化對(duì)大鼠的證候和證候療效做出初步闡釋。如果結(jié)合其他代謝組學(xué)技術(shù)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多有意義的代謝物，以便更深入地闡釋糖尿病病證結(jié)合大鼠的證候特征以及證候療效的科學(xué)內(nèi)涵。由于國內(nèi)關(guān)于代謝組學(xué)的研究起步較晚，而涉及糖尿病中醫(yī)學(xué)范疇的文獻(xiàn)研究也比較少，因此可借鑒的研究結(jié)果為數(shù)不多。對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果在2型糖尿病病證結(jié)合動(dòng)物模型的其他證型中是否有相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果或者出現(xiàn)新的標(biāo)志性代謝物，這將是課題組今后實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)所在。

受到大鼠樣本量的限制和大鼠模型的個(gè)體差異，各組大鼠尿液代謝物在種類和含量上出現(xiàn)一定程度的偏差，筆者建議在今后的實(shí)驗(yàn)中可以從兩方面進(jìn)行改進(jìn)。首先可以增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的樣本量，二是可以提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的造模嚴(yán)重程度，有利于發(fā)現(xiàn)差異明顯的代謝物群。此外，作為最終代謝物，大鼠的尿液可能在疾病程度較輕的階段不出現(xiàn)明顯的變化，筆者認(rèn)為可以結(jié)合血液檢測(cè)方法開展血液代謝組學(xué)研究，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)與糖、脂、蛋白代謝紊亂明顯相關(guān)的生物標(biāo)志物。同時(shí)，今后的研究也可以借助系統(tǒng)生物學(xué)的其他技術(shù)方法如蛋白組學(xué)和基因組學(xué)，深入開展2型糖尿病大鼠病證結(jié)合研究，期望通過不同組學(xué)技術(shù)交叉印證證候的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制，并借助復(fù)雜統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，將系統(tǒng)生物學(xué)結(jié)果與一般實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、宏觀表征融合成有機(jī)的整體，探索出一條由宏觀延伸到微觀、由微觀反證宏觀的有效實(shí)驗(yàn)方法，探尋宏觀指標(biāo)和微觀指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性，努力找到可以代替微觀指標(biāo)的宏觀指標(biāo)，以此加快證候研究的步伐。

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