錢小峰，柳 艷，陳 輝，陸 峰（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海 200433）

?論著?

基于藥用輔料的拉曼光譜鑒別絡(luò)活喜仿冒藥研究

錢小峰，柳 艷，陳 輝，陸 峰（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海 200433）

目的針對(duì)藥物活性成分與原研藥質(zhì)量相同的一類仿冒藥，以苯磺酸氨氯地平片原研藥及仿冒藥為工具藥，建立基于兩者所用藥用輔料的差異，用于鑒別絡(luò)活喜仿冒藥的方法。方法收集絡(luò)活喜片劑常用輔料的拉曼光譜，采用相似度算法及特征峰查找待檢樣品中輔料，若待檢樣品的輔料與原研藥輔料不同則判為仿冒藥；若待檢品輔料與原研藥輔料相同，則采用主成分分析法區(qū)分仿冒藥與原研藥。結(jié)果與結(jié)論該方法可快速、準(zhǔn)確地鑒別絡(luò)活喜仿冒藥。

藥用輔料；拉曼光譜；仿冒藥；相似度法；特征峰；主成分分析

藥品仿冒是一種性質(zhì)嚴(yán)重的犯罪活動(dòng)，其不僅侵犯知識(shí)產(chǎn)權(quán)，并且已經(jīng)成為有組織的犯罪新分支，為恐怖分子活動(dòng)提供資金［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）表示，全球范圍內(nèi)10%的藥品為仿冒藥［2］。因此，研究建立快速、準(zhǔn)確的藥品鑒別方法迫在眉睫。WHO已將仿冒藥定義為“假造、貼錯(cuò)標(biāo)簽、偽造、仿冒藥品（SFFC）”［3］。

通常，對(duì)仿冒藥的篩查從樣品表觀開(kāi)始，包括藥品本身，如：重量、形狀、顏色、外觀等，以及包裝如：箱、盒、泡形罩、玻璃小瓶、說(shuō)明書、批號(hào)日期、印刷質(zhì)量、商標(biāo)標(biāo)示等。此外，理化測(cè)試包括比色法［4］、溶解度［5］、密度、黏度檢測(cè)［6］等，速度快且費(fèi)用低。但是，這些檢測(cè)并不能提供樣品內(nèi)容物信息。

拉曼光譜在仿冒藥的鑒別領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。本研究主要針對(duì)藥物活性成分（API）與原研藥相同的一類仿冒藥，選擇WHO列出的必需藥品之一苯磺酸氨氯地平片為工具藥。僅根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》所示方法尚不能鑒別仿冒藥。本研究收集20種常用片劑輔料的拉曼光譜，構(gòu)成片劑輔料拉曼光譜庫(kù)（簡(jiǎn)稱：輔料庫(kù)），計(jì)算待檢樣品輔料與原研藥輔料的相似度，并結(jié)合特征峰的峰位及強(qiáng)度，如果待檢藥品輔料與原研藥絡(luò)活喜輔料不同，判為仿冒藥；反之，則采用主成分分析的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)此類仿冒藥的準(zhǔn)確鑒別。

1 材料與儀器

1.1 材料 常用片劑輔料（上海信誼藥廠）；原研藥絡(luò)活喜（A.輝瑞公司生產(chǎn)），本研究所涉及處方均由廠家提供，共收集6個(gè)廠家的苯磺酸氨氯地平片，API規(guī)格均為5 mg。絡(luò)活喜A處方：微晶纖維素、磷酸氫鈣、羧甲淀粉鈉、硬脂酸鎂；廠家B處方：微晶纖維素、磷酸氫鈣（較多）、羧甲淀粉鈉（少量）、硬脂酸鎂（少量）、羥丙甲纖維素（少量）；廠家C處方：乳糖（僅告知部分處方）；廠家D處方：淀粉、甘露醇、硬脂酸鎂、羥丙纖維素、預(yù)膠化淀粉、羥丙甲纖維素；廠家E處方：微晶纖維素、磷酸氫鈣、淀粉、羧甲淀粉鈉、硬脂酸鎂；廠家F處方：羧甲淀粉鈉、微晶纖維素、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、淀粉。

1.2 儀器 采用B＆W Tek便攜式拉曼光譜儀（i-Raman）進(jìn)行樣品光譜采集。拉曼光譜儀采用半導(dǎo)體致冷型CCD檢測(cè)器，激光源波長(zhǎng)：785 nm，激光器功率：100 mW，光束直徑：2 mm，光譜分辨率：3.5 cm－1，波數(shù)范圍：65～2 700 cm－1。

2 方法

2.1 采樣方法 將輔料、原研藥、仿冒藥分別置于載玻片上，手動(dòng)調(diào)整焦距，采樣積分時(shí)間：5×3 s，每個(gè)樣品進(jìn)行多個(gè)位置采樣，以多張拉曼光譜的平均值作為該樣品的拉曼光譜。

2.2 光譜預(yù)處理方法 輔料及樣品所采集的拉曼光譜均采取同樣的預(yù)處理方法，截波范圍100～1 800 cm－1，平滑去除由于物理因素產(chǎn)生的噪音，基線校正采用Rubberband correction算法，標(biāo)準(zhǔn)化采用min-max normalization。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 采樣時(shí)間間隔24 h，連續(xù)5 d對(duì)同一供試品按照“2.1”及“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得出5次采樣光譜的相似度均＞0.95，峰位偏差不足1個(gè)波數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品在拉曼光譜檢測(cè)過(guò)程中具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 將同一供試品平均分為5份，在相同的測(cè)量環(huán)境下，按照“2.1”及“2.2”項(xiàng)下方法對(duì)5份供試品進(jìn)行拉曼光譜采集。計(jì)算得出5份供試品拉曼光譜的相似度均＞0.95，峰位偏差不足1個(gè)波數(shù)，結(jié)果表明，用拉曼光譜儀檢測(cè)供試品具有較好的精密度。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)同種供試品5份，在相同的測(cè)量環(huán)境下，按照“2.1”及“2.2”項(xiàng)下方法對(duì)5份供試品進(jìn)行拉曼光譜采集。計(jì)算得出5份供試品拉曼光譜的相似度均＞0.95，峰位偏差不足1個(gè)波數(shù)，結(jié)果表明，拉曼光譜技術(shù)具有較好的重復(fù)性。

2.4 分析策略 本研究嘗試建立原研藥與仿冒藥的兩步鑒別法。①采集待檢樣品及原研藥的拉曼光譜圖，經(jīng)過(guò)光譜預(yù)處理后，將待檢樣品及原研藥光譜與輔料庫(kù)中光譜分別計(jì)算相似度。②若與某種藥用輔料相似度值達(dá)0.9以上，則判斷待檢樣品中含有該藥用輔料，并用特征峰對(duì)該藥用輔料進(jìn)行驗(yàn)證。若與輔料庫(kù)內(nèi)藥用輔料相似度值達(dá)不到閾值0.9，則提示樣品中可能含有某種輔料，標(biāo)出樣品中輔料的特征峰位置及強(qiáng)度，用這些特征峰對(duì)比輔料庫(kù)中輔料的特征峰位置及強(qiáng)度。如果樣品輔料與原研藥輔料不同，則可明確判定為仿冒藥；如果查找得出樣品輔料與原研藥輔料相同，則需要收集不同批次的原研藥及仿冒藥，使用主成分分析法進(jìn)行鑒別。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 常用片劑輔料的拉曼光譜 圖1為20種輔料的拉曼光譜圖。

3.2 輔料不同的原研藥與仿冒藥鑒別 仿冒藥生產(chǎn)者首先會(huì)對(duì)原研藥進(jìn)行大量資料調(diào)研，而絡(luò)活喜處方中所使用的輔料易于獲取，不法分子通過(guò)化工廠購(gòu)買原料藥，再仿冒、甚至高價(jià)回收原研藥的外包裝盒，蒙騙消費(fèi)者，給患者帶來(lái)傷害。

從圖2可見(jiàn)，B、C、D廠家的拉曼圖譜與原研藥A絡(luò)活喜有較大區(qū)別，而E、F廠家與原研藥較為相似。計(jì)算各廠家與輔料庫(kù)光譜的相似度值，并在扣除片劑中API的特征峰后，根據(jù)特征峰查找各廠家藥片中可能含有的輔料，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析。

如圖2A所示，B廠家光譜與輔料庫(kù)中磷酸氫鈣的相似度為0.835 37（小于閾值0.9），采用特征峰查找為主要鑒別方法，B廠家藥片主要特征峰為：1 381cm－1（w），1 124 cm－1（w），1 094 cm－1（w），1 059 cm－1（w），987 cm－1（vs），880 cm－1（w），523 cm－1（m），409 cm－1（m），381 cm－1（s）和208 cm－1（w），而磷酸氫鈣主要特征峰為：1 058 cm－1（w），987 cm－1（vs），879 cm－1（w），587 cm－1（w），523 cm－1（m），411 cm－1（m），380 cm－1（s）和207 cm－1（w），兩者主要特征峰強(qiáng)度及位置相一致的個(gè)數(shù)有7個(gè)，由此可判斷B廠家樣品含有磷酸氫鈣。原研藥絡(luò)活喜中雖然含有磷酸氫鈣，但是由于仿冒藥廠家中含有大量磷酸氫鈣，其拉曼光譜峰主要體現(xiàn)了磷酸氫鈣的拉曼峰，由此能夠鑒別B廠生產(chǎn)的是仿冒藥。

由圖2B可見(jiàn)，C廠家光譜與輔料庫(kù)中乳糖的相似度為0.990 82，以相似度為主要鑒別方法，判斷其中含有乳糖。同時(shí)，查找特征峰作為驗(yàn)證，C廠家的主要輔料特征峰為：259 cm－1（w），358 cm－1（vs），378 cm－1（s），398 cm－1（w），478 cm－1（m），554 cm－1（w），852 cm－1（m），877 cm－1（m），916 cm－1（w），954 cm－1（w），1 020 cm－1（w），1 053 cm－1（w），1 087 cm－1（s），1 121 cm－1（m）和1 263 cm－1（w）。C廠家與藥用輔料乳糖的特征峰強(qiáng)度及位置相一致的有10個(gè)，可判斷其中含有乳糖，而原研藥中不含乳糖，因此，判定C廠家生產(chǎn)的是仿冒藥。

D廠家與輔料庫(kù)中甘露醇的相似度值為0.854 2（小于閾值0.9），以特征峰查找為主要鑒別方法。如圖2C所示，D廠家主要輔料特征峰為369 cm－1（w），478 cm－1（m），518 cm－1（m），788 cm－1（w），850 cm－1（m），875 cm－1（vs），1 037 cm－1（m），1 131 cm－1（w），1 354 cm－1（w）和1 460 cm－1（w），查找特征峰發(fā)現(xiàn)主要輔料為甘露醇，輔料庫(kù)中甘露醇的特征峰為244 cm－1（w），288 cm－1（w），369 cm－1（w），477 cm－1（s），494 cm－1（w），789 cm－1（w），876 cm－1（vs），1 038 cm－1（s）和1 135 cm－1（w），D廠產(chǎn)品與甘露醇的特征峰強(qiáng)度及位置相一致的個(gè)數(shù)為6，可判斷其中含有甘露醇。而原研藥輔料中不含甘露醇，因此判定D廠家生產(chǎn)的是仿冒藥。此方法的優(yōu)勢(shì)在于：通過(guò)一片藥就可以將可疑樣品與原研藥加以鑒別，具有用量較少、特征明顯、容易鑒別的特點(diǎn)。

3.3 輔料相似的原研藥與仿冒藥鑒別 E、F廠家樣品的拉曼光譜與原研藥較相似，按上述方法，原研藥、E、F廠家與輔料庫(kù)中微晶纖維素的相似度值分別為0.954 27、0.953 67、0.818 24，結(jié)合查找特征峰，發(fā)現(xiàn)各廠家樣品中均含有微晶纖維素（表1）。

圖1 20種常用片劑藥用輔料拉曼光譜圖

表1 3個(gè)廠家樣品和微晶纖維素的特征峰查找結(jié)果

主成分分析（PCA）是一種數(shù)學(xué)降維技術(shù)，運(yùn)用少數(shù)變量代替處理前的眾多變量，盡可能表達(dá)原有信息，以達(dá)到提取特征信息的目的。應(yīng)用SIMCA-P軟件，得到2個(gè)主成分PC1和PC2的得分（圖3），反映各樣品的聚集程度［7］。本研究共收集原研藥A絡(luò)活喜7個(gè)批次，E廠樣品7個(gè)批次，F(xiàn)廠樣品6個(gè)批次，每批次樣品采集3次，求得各批次的平均光譜。如圖3所示，原研藥的光譜能夠較好地聚在一起，E、F廠樣品與原研藥均有一定距離。

圖2 各廠家苯磺酸氨氯地平片及其主要輔料的拉曼光譜圖

圖3 PCA分析絡(luò)活喜與待檢樣品拉曼光譜的得分圖

4 結(jié)論

本研究針對(duì)“專業(yè)仿冒”——API相同、生產(chǎn)工藝不同的一類仿冒藥。建立基于輔料的仿冒藥鑒別方法，能夠提供部分內(nèi)容物信息，結(jié)果快速、準(zhǔn)確、可靠，可為快速鑒別仿冒藥提供參考。

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Identification of Norvasc and counterfeit drugs based on Raman spectra of pharmaceutical excipients

QIAN Xiaofeng，LIU Yan，CHEN Hui，LU Feng（Department of Pharmaceutical Analysis，Schoolof Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo build an identificationmethod for Norvascand its counterfeit drugs based on the differences of their pharmaceutical excipientswith the original and generic Am lodipine besylatetablets as tools.MethodsRaman spectra of pharmaceutical excipientswhich were usually used in tabletswere collected.Sim ilarity algorithm and characteristic Raman bands were used to search the excipients contained in the tablets.If the excipients was not the same as excipients contained in Norvasc，the tabletwas judged as counterfeit drugs.Otherw ise，principal component analysiswas used to identify counterfeit and generic.Results and conclusionThemethod based on Raman spectra of pharmaceutical excipients could identify Norvasc and counterfeit drugs efficiently and accurately.

pharmaceutical excipients；Raman spectrum；counterfeit drugs；sim ilarity algorithm；characteristic Raman bands；PCA

R927

A

1006-0111（2015）04-0334-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.012

2014-07-09

2015-01-14［本文編輯］李睿旻

錢小峰，碩士研究生.Tel：13817636166；E-mail：xiaofengtou＠126.com

陸 峰，教授.研究方向：藥物質(zhì)量信息學(xué).E-mail：fenglufeng＠hotmail.com