余 曉，羅 果（遵義醫(yī)學(xué)院：.生物化學(xué)教研室；.醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義563000）

杜仲是中國(guó)特有的名貴中藥材和工業(yè)原料樹種。研究表明，杜仲含許多有效藥用成分，如黃酮類、木脂類、萜類、糖類、生物堿和抗真菌蛋白等[1]，其中黃酮類化合物具有抗病毒、抗衰老、抗氧化、抑菌、降脂減肥[2]、抗癌防癌等作用[3]。

乙型肝炎是由嗜肝的乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種在世界范圍的傳染性疾病，全世界約有3.5億人感染HBV，我國(guó)約占一半。乙型肝炎給人類健康造成極大的危害，尋求高效低毒的抗HBV的天然藥物已經(jīng)刻不容緩[4]。本實(shí)驗(yàn)擬用轉(zhuǎn)染HBV的人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15作為研究對(duì)象[5]，觀察杜仲總黃酮抗HBV的效果，為杜仲抗HBV的藥效成分篩選以及杜仲天然產(chǎn)物的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 杜仲皮采自貴州省正安縣田生村。轉(zhuǎn)染HBV的人肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 試劑 HBV熒光定量試劑盒（達(dá)安基因公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（GIBCO公司）；乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）試劑盒（華美公司）；胎牛血清（四季青公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200806）。拉米夫定[葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司，批號(hào)：10090046]。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；ELX800通用酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-techInc公司）；CO2孵箱（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 杜仲總黃酮的提取與含量測(cè)定 將杜仲皮制成粉狀，采用乙醇分段（60%～90%）提取法提取，醋酸鉛胺沉淀過(guò)濾，濃縮后過(guò)大孔樹脂、聚酰胺和硅膠柱，將過(guò)柱后樣品與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁對(duì)照，測(cè)得總黃酮含量為69%。

1.2.2 杜仲總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×105mL-1，將細(xì)胞接種于 96 孔板，每孔 200 μL，待其貼壁后，棄掉原培養(yǎng)液。在杜仲總黃酮不同劑量組各孔分別加入總黃酮濃度為 25、50、100、200 μg/mL 培養(yǎng)液200 μL，另設(shè)不加藥細(xì)胞培養(yǎng)孔為空白對(duì)照組，每組重復(fù)6孔。將各組細(xì)胞置CO2孵箱培養(yǎng)72 h，采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞在490 nm處的OD值。計(jì)算不同濃度杜仲總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率[6]。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（空白對(duì)照組OD值-杜仲總黃酮不同劑量組OD值）/劑量組OD值×100%。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算半數(shù)毒性濃度（TC50）。

1.2.3 不同濃度杜仲總黃酮對(duì)HBV-DNA的作用 按1.2.2項(xiàng)下方法加入不同濃度的杜仲總黃酮藥液，另設(shè)藥物拉米夫定（50 μg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，每組重復(fù)3孔。置CO2孵箱培養(yǎng)72 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液提取HBVDNA，采用Real-time PCR法測(cè)定HBV-DNA拷貝數(shù)。記錄閾值（Ct值），計(jì)算各樣品的HBV-DNA起始拷貝數(shù)和抑制率[7]。DNA抑制率=（空白對(duì)照組拷貝數(shù)-劑量組拷貝數(shù)）/空白對(duì)照組拷貝數(shù)×100%。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量測(cè)定按1.2.2項(xiàng)下方法加入不同濃度的杜仲總黃酮藥液并設(shè)置空白對(duì)照組，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定。測(cè)定方法按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處OD值，并計(jì)算抑制率[8]。HBsAg或HBeAg抑制率=（空白對(duì)照組OD值-劑量組OD值）/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以ss表示，采用方差分析。Р＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 杜仲總黃酮各劑量組（25、50、100、200 μg/mL）的 OD 值均低于空白對(duì)照組，說(shuō)明杜仲總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。其中，杜仲總黃酮 50、100、200 μg/mL劑量組的抑制率與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。提示杜仲總黃酮的 TC50＞200 μg/mL，因此，本實(shí)驗(yàn)選取小于或等于200 μg/mL的濃度檢測(cè)杜仲總黃酮的抗HBV作用。

表1 杜仲總黃酮對(duì)HepG2.2.15生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 不同濃度杜仲總黃酮對(duì)細(xì)胞上清液中HBV-DNA的影響 用杜仲總黃酮和拉米夫定分別作用細(xì)胞72 h，應(yīng)用Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，杜仲總黃酮各劑量組和拉米夫定對(duì)HBV-DNA的復(fù)制均有抑制作用，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 杜仲總黃酮、拉米夫定對(duì)細(xì)胞上清液中HBV-DNA的影響

2.3 杜仲總黃酮對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量的影響 用杜仲總黃酮和拉米夫定分別作用72 h，ELISA法測(cè)定細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg量，采用OD值表示。結(jié)果顯示，杜仲總黃酮各劑量組和拉米夫定對(duì)HBsAg及HBeAg的分泌均有抑制作用，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3、4。

表3 杜仲總黃酮、拉米夫定對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用

表4 杜仲總黃酮、拉米夫定對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用

3 討 論

黃酮類化合物是杜仲主要活性成分之一，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫力等多種功效。目前已經(jīng)有其他物種的黃酮抗HBV的研究報(bào)道[9-11]，而對(duì)杜仲黃酮抗HBV的相關(guān)研究報(bào)道較少。

本研究以轉(zhuǎn)染HBV的HepG2.2.15細(xì)胞為研究對(duì)象，該細(xì)胞能持續(xù)分泌HBV和相關(guān)抗原，研究杜仲總黃酮對(duì)該細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的影響[12]。結(jié)果顯示，不同濃度的杜仲總黃酮和拉米夫定均對(duì)HBVDNA復(fù)制有較強(qiáng)的抑制作用。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg檢測(cè)表明，不同濃度的杜仲總黃酮、拉米夫定均對(duì)HBsAg和HBeAg的有抑制作用，其中對(duì)HBV-DNA的復(fù)制抑制作用強(qiáng)于對(duì)HBsAg和HBeAg的作用，說(shuō)明總黃酮抗HBV的機(jī)制可能與抑制病毒DNA復(fù)制有關(guān)。研究結(jié)果表明，杜仲總黃酮在體外具有抗HBV的作用，但是其全面的抗病毒作用還需結(jié)合動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)證明，其抗病毒機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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