潘冰燕，魯曉翔，張鵬，李江闊，陳紹慧

1(天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津，300134)

2(國家農產品保鮮工程技術研究中心，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)

辣椒中葉綠素和類胡蘿卜素的組成及含量不僅影響辣椒的商品價值，也影響其內部營養(yǎng)品質，是反映辣椒品質的重要指標之一。天然類胡蘿卜素在生物體內具有抗氧化性，能降低人的癌癥風險、增加免疫能力。西班牙學者的研究表明［1］，辣椒果實成熟過程中大量合成的紅色類胡蘿卜素為辣椒所特有。葉綠素共有葉綠素a、b、c和d四種，在綠色植物中主要為葉綠素a和b。傳統(tǒng)方法對辣椒中葉綠素、類胡蘿卜素的檢測，時間長，操作流程繁瑣，不適合現(xiàn)場對辣椒品質的快速檢測。因此，開發(fā)一種簡便、無損的葉綠素、類胡蘿卜素含量快速檢測方法對監(jiān)控物流過程中辣椒品質變化具有重要意義［2］。

近紅外光是波長介于可見區(qū)與中紅外區(qū)之間的電磁波，其波長約為800～2 500 nm，波數(shù)約為12 500～4 000 cm－1。利用近紅外光譜技術(near infrared reflectance spectrum，NIRS)測試樣品，不需預處理就能直接對試樣進行測試，操作方便，非常適合食品的定性和定量的快速分析［3－6］。近年來，NIRS在食品品質無損檢測方面得到迅速發(fā)展和應用。Davey等［7］通過近紅外光譜測定香蕉中的類胡蘿卜素含量。郭衛(wèi)東等［8］建立了用于測定櫻桃中糖含量的CWT-GRNN預測校正模型;Park［9］分析了近紅外光譜對水果SSC和硬度的預測水平;石吉勇等［10］利用NIRS對黃瓜植株氮、鎂元素的虧缺進行診斷;果蔬品質無損檢測在國內外已有一定研究［11］，有的已實現(xiàn)商業(yè)應用，但關于利用NIRS無損檢測辣椒葉綠素、胡蘿卜素的報道卻鮮見。本文利用NIRS對線椒的葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量進行檢測，建立貨架期線椒鮮果內部品質快速、無損檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原料:線椒采收時選取成熟度一致(八成熟、綠色)、無病蟲害和機械損傷，并在當天運回實驗室，待線椒的溫度與室溫一致時，用微孔袋(厚度16 μm)包裝。置于常溫(可控溫度為18～20℃)下存放。

每隔24 h進行光譜測定，每次隨機抽取30個樣品，光譜測定后再進行化學成分含量的測定。測定前將辣椒表面拭擦干凈，并對其進行排序編號，之后進行全光譜掃描。剔除異常數(shù)據(jù)之后，試驗共抽取180個數(shù)據(jù)，其中定標集135個和驗證集45個。

1.2 光譜采集

試驗使用NIRSDS2500近紅外漫反射光譜儀(丹麥Foss公司)，采用全息光柵分光系統(tǒng)，信號采集由硅(400～1 100 nm)和硫化鉛(1 100～2 500 nm)檢測器完成，掃描波長范圍為400～2 500 nm，以單波長方式進行快速掃描，掃描次數(shù)為32次，配置Nova分析軟件和WinISI4定標軟件，將每一個線椒樣品的中部凸表面點作為NIR漫反射光譜的采集點，要求避開表面缺陷部位，并對掃描部分進行化學測量。

1.3 葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的化學測定

參考Lichtenthaler等［12］提出的方法，稍做調整。準確稱取切碎的辣椒鮮果0.500 g，放入研缽中，加入少量的石英砂和CaCO3粉以及2～3 mL的體積分數(shù)(下同)95%乙醇研成勻漿，再加95%乙醇10 mL，繼續(xù)研磨至組織變白，靜置3～5 min，用濾紙過濾到25 mL棕色瓶中，用95%乙醇定容。以95%的乙醇為空白，用紫外分光光度計分別在波長665、649、470 nm下測定吸光度。根據(jù)公式(1)、(2)和(3)進行葉綠素和類胡蘿卜素的百分含量計算。

其中:m，樣品質量，g;Ca，葉綠素 a含量，%;Cb，葉綠素 b含量，%;Cx*c，類胡蘿卜素含量，%;D665、D649、D470分別是 665、649、470 nm 下的吸光度值;Ca、Cb和Cx*c分別乘以1 000可得到葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量(按mg/100g計)。

1.4 模型的建立與驗證

利用WinISI4軟件，對原始光譜進行濾波和平滑處理，以去除噪聲，并提取有效信息，采用不同預處理確定線椒葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素無損預測模型;然后，再用未參與定標的樣品對模型進行驗證，評價模型的可行性。為了模型的實用性，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量的最小值以及最大值被選入定標樣品集中。以定標集相關系數(shù)RCV和交叉驗證誤差(standard error of cross validation，SECV)，驗證集相關系數(shù)RP和驗證標準誤差(standard error of prediction，SEP)為模型的評價標準。通常，所建立模型的RCV和RP越大，SECV和SEP越小，模型的效果越好［13］。本實驗模型定標集和驗證集樣品的分布特征如表1所示。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)分析基本參數(shù)

選取線椒果實凸表面點做好標記，并對標記點處進行掃描，得到線椒果實的原始近紅外掃描光譜圖1。

表1 定標集和驗證集樣品的分布特征Table 1 Characteristics of calibration and prediction

圖1 貨架期間辣椒原始光譜圖Fig.1 Original absorption spectrum of shelf-life of Line pepper

圖1為貨架期間線椒鮮果的180個原始吸收光譜圖，近紅外光譜會受到化學成分種類和含量的影響，而樣品本身物理性質也會影響其光譜。從圖1中可以看出光譜在波長為677、975、1 191、1 448 nm 的處有明顯吸收峰。通過WinISI 4軟件分析可知，在可見光區(qū)，出現(xiàn)第一個明顯的吸收峰(677 nm)，這可能是由果皮葉綠素對光的吸收造成的［14］。而水分對近紅外的吸收帶為960 ～990 nm;1 198 ～1 270 nm［15］。也有研究認為［16］，975 nm和1 448 nm的吸收可能是由水和CO2的吸收引起的。陸婉珍等［17］的研究則認為，果蔬成分中基本化學基團(C—H、O—H)的倍頻吸收譜帶也在這幾個峰附近。這說明近紅外光譜圖捕獲的信息與線椒鮮果內在品質之間存在著一定的變化規(guī)律。

2.2 不同預處理方法的選擇

采用改進最小偏二乘法(MPLS)，研究光譜不同導數(shù)處理方法結合不同散射和標準化方法處理模型的方法，從而找出最優(yōu)的模型。在全光譜范圍內(400～2 500 nm)比較了原始光譜［Log(1/R)］、一階微分光譜［D1Log(1/R)］、二階微分光譜［D2Log(1/R)］和去散射處理(Detrend)、標準正?；幚?SNV)、SNV和Detrend、標準多元離散校正(standard multivariate discrete calibration，SMSC)、加權多元離散校正(weighted multivariate discrete calibration，WMSC)相結合的方法建立的模型。王加華等［18］的研究指出，多元離散校正(MSC)可以解決樣品的不均勻、粒徑大小和光程長短等物理特性對光譜的影響;導數(shù)光譜可對基線和其他背景的干擾進行有效地消除，分辨重疊的峰，達到提高分辨率的效果，但其同時也會引入噪聲，降低信噪比。

本實驗在全光譜范圍內比較葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的相關系數(shù)RCV和交叉驗證誤差SECV，用不同光譜預處理方法建模的結果如表2所示。

表2 葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量不同預處理的定標結果Table 2 Statistical results of Chlorophyll a and Chlorophyll b and Carotenoids by different pretreatment

結果表明，對于葉綠素a和葉綠素b都是采用MPLS、D1Log(1/R)、Detrend處理的定標模型較好，交互驗證相關系數(shù)(RCV)分別為0.907和0.896，交互驗證誤差(SECV)分別為0.744和1.544;對于類胡蘿卜素，采用 MPLS、Log(1/R)、Detrend處理的定標模型較好，交互驗證相關系數(shù)(RCV)、交互驗證誤差(SECV)分別為0.902和0.336。

表3 葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量最優(yōu)預處理不同波段下的定標結果Table 3 Statistical results of Chlorophyll a and Chlorophyll b and Carotenoids in best pretreatment at different bands

針對葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量的最優(yōu)預處理進行不同波段的討論，結果見表3。表明在408～1 092.8 nm波長下建立的模型的交互驗證相關系數(shù)(RCV)、交互驗證誤差(SECV)略小于全波長建立的模型，而在波長1 108～2 492.8 nm下所建立的模型效果不好。這可能是由于葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的光譜吸收峰大多集中在可見光區(qū)域或短波近紅外區(qū)域，模型的光譜信息主要在這段區(qū)域。

2.3 葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量近紅外檢測模型建立及分析

為了預測定標模型的可靠性和準確性，用建立好的最優(yōu)定標模型分別對45個未知辣椒果實的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量進行預測分析，實測值與預測值相關性分別如圖2～圖4所示。

預測結果表明，葉綠素a的預測標準誤差(SEP)為0.894，預測相關系數(shù)(RP)為0.890 2;葉綠素b的預測標準誤差(SEP)為1.647，預測相關系數(shù)(RP)為0.923 7;類胡蘿卜素的預測標準誤差(SEP)為0.361，預測相關系數(shù)(RP)為0.905 9?？梢?，葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素都可以進行很好的預測。因此，可見/近紅外漫反射對線椒鮮果葉綠素、類胡蘿卜素的快速無損檢測是可行可靠的。

圖2 葉綠素a實測值與預測值相關性Fig.2 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of chlorophyll a

圖3 葉綠素b實測值與預測值相關性Fig.3 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of chlorophyll b

圖4 類胡蘿卜素實測值與預測值相關性Fig.4 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of carotenoids

3 結論

本研究應用近紅外漫反射光譜結合改進偏最小二乘法(MPLS)建立了線椒鮮果葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的定量模型。MPLS是一種全光譜分析方法，充分利用多個波長下的有用信息，無需刻意地選擇波長，解決交互影響的非線性問題，很適合在近紅外中使用。通過對不同預處理方法模型的比較，得出在MPLS校正模型下，葉綠素a以及葉綠素b最優(yōu)的預處理方法為D1Log(1/R)+Detrend處理，對采集到的原始光譜進行一階導預處理［D1Log(1/R)］，可以過濾噪聲，提高信噪比，消除基線飄移的干擾，提高模型質量;類胡蘿卜素的最優(yōu)預處理方法為Log(1/R)+Detrend?？梢?，去散射處理(Detrend)對這3種組分的模型最優(yōu)，這可能是由于辣椒果皮對近紅外光的透入有較大影響，但這種影響可以通過Detrend處理被減小或被補償，這在趙杰文等［18］的研究中也曾得到證明。葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素的最優(yōu)處理方法不同，說明對于不同物質間的最優(yōu)模型的預處理方法有所不同。葉綠素b與類胡蘿卜素的預測相關系數(shù)(RP)都達到了0.9以上，葉綠素a預測相關系數(shù)(RP)也達到了0.890 2。實驗結果表明，近紅外漫反射光譜技術能克服傳統(tǒng)分析方法的繁雜處理過程，實現(xiàn)對辣椒鮮果中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的同時快速無損檢測，從而達到評價線椒貨架期品質的目的，而且一次測定可同時預測葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量，實用性更強。本研究方法可利用在對線椒鮮果貨架及貯藏期品質的檢測方面。

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