張志芳，潘道東，2，孫楊贏，曹錦軒，曾小群

1(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江寧波，315211)2(南京師范大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，江蘇南京，210097)

肌原纖維蛋白質(zhì)熱誘導(dǎo)凝膠特性是肉制品加工生產(chǎn)中最重要的功能特性之一［1］。肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白，在加熱時(shí)能夠形成凝膠，從而影響肉制品的咀嚼性、硬度和出品率等。肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性不僅受蛋白濃度、蛋白分子結(jié)構(gòu)影響，還受加工條件(如加熱溫度、加熱速率)、溶液環(huán)境(如pH值、離子強(qiáng)度)等因素的影響［2－4］，因此研究肉制品肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性，對(duì)肉制品產(chǎn)品的研發(fā)與加工具有重要的意義。麻鴨的蛋白含量高，可食部分鴨肉中的蛋白質(zhì)含量約16% ～25%，比豬肉、羊肉等畜肉含量高，脂肪和膽固醇較于其他肉類低，是很好的現(xiàn)代養(yǎng)生健康食品［5－6］。然而，現(xiàn)今我國(guó)在對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性的研究方面，大多以豬肉［7］與雞肉［8］為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)以麻鴨胸肉為研究材料，研究其肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻鴨，購(gòu)于浙江寧波鎮(zhèn)海江南家禽育種有限公司。(麻鴨日齡為360 d、體重為2 kg，放血去毛取鴨胸脯肉，于－40℃冰箱存放。)

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)，上海雷磁儀器廠;TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀，StableMicro System公司;美國(guó)貝克曼Allerga高速冷凍離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特有限公司;M200全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Tecan公司;XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取制備

肌原纖維蛋白提取參照張玉林［9］方法并稍加改動(dòng)。取解凍好的鴨胸脯肉加入7.5倍體積的焦磷酸鹽飽和緩沖液(100 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA-2Na，1 mmol/L DTT，2 mmol/L Na4P2O7，10 mmol/L Maleate;pH 6.8)中，剪碎，勻漿，冷凍離心，去上清取沉淀。將沉淀物重新分散在7.5倍體積的肌原纖維蛋白提取液(100 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA-2Na，1 mmol/L DTT，10 mmol/L Maleate;pH 6.8)中，勻漿，冷凍離心，取沉淀，提取的沉淀按上述步驟反復(fù)提取，最后一次用紗布過(guò)濾。將多次提取的沉淀最后用15 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌3次，用紗布過(guò)濾即得到純化的肌原纖維蛋白。蛋白濃度用BCA試劑盒測(cè)定。

1.3.2 肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠制備

參考李亞楠等［10］的方法，略作修改。選取蛋白濃度、pH、NaCl溶液濃度、蛋白凝膠溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，改變其中1個(gè)因素，其他3個(gè)因素水平保持不變。

蛋白濃度:用緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液，pH 6.5)將蛋白濃度分別稀釋為20、30、40、50、60、70 mg/mL，水浴加熱，從 30 ℃以 0.5 ℃ /min線性升溫到70℃，保溫40 min，放置4℃冷卻。

溶液pH:用緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液)將蛋白濃度分別稀釋為40 mg/mL，將溶液 pH 分別調(diào)為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，水浴加熱，從30℃以0.5℃/min線性升溫到70℃，保溫40 min，放置4℃冷卻。

NaCl濃度:用不同濃度的緩沖溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液，pH 6.5)將蛋白濃度稀釋到40 mg/mL，水浴加熱，從30℃以0.5℃/min線性升溫到70℃，保溫40 min，放置4℃冷卻。

凝膠溫度:用緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液，pH 6.5)將蛋白稀釋到40 mg/mL，水浴加熱，從30℃以0.5℃/min線性升溫到 50、60、70、80、90、100 ℃，保溫 40 min，于 4 ℃冷卻。

1.3.3 凝膠保水性測(cè)定

參照 Kocher［11］的方法，蛋白形成凝膠后，在3 000 r/min下離心20 min，對(duì)離心前后蛋白凝膠和試管進(jìn)行稱量。蛋白質(zhì)凝膠的保水性:

WHC/%= ［(m1－m)/(m2－m)］×100

式中:m1為離心后試管與蛋白凝膠的質(zhì)量;m2為離心前試管和蛋白凝膠的質(zhì)量;m為離心管質(zhì)量。

1.3.4 凝膠質(zhì)構(gòu)分析測(cè)定

參照Marta［12］的方法略有改動(dòng)。采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀對(duì)蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為:測(cè)試探頭(P/5)，測(cè)前速度 l.0 mm/s，測(cè)試速度l.0 mm/s，剌穿距離3 mm，感應(yīng)力5 g，停留時(shí)間5 s。利用自帶軟件得到蛋白凝膠的相關(guān)質(zhì)構(gòu)參數(shù):黏性、硬度、彈性。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定5次，取平均值。

1.3.5 蛋白凝膠的綜合素質(zhì)評(píng)定

參照趙紫薇等［13］的方法略作改動(dòng)。根據(jù)蛋白凝膠樣品質(zhì)量的指標(biāo)內(nèi)容，以及保水性、硬度、彈性、黏性4個(gè)因素對(duì)蛋白凝膠的重要程度的不同。設(shè)定權(quán)重向量A和蛋白凝膠樣品質(zhì)量指標(biāo)集U，計(jì)算蛋白凝膠的綜合評(píng)價(jià)得分。

各個(gè)因素的權(quán)重向量 A=(a1，a2，a3，a4)=(0.3，0.3，0.2，0.2)，并且 a1+a2+a3+a4=1。

1.3.6 響應(yīng)曲面分析法實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取溶液pH、Nacl濃度、凝膠溫度這3個(gè)因素在3個(gè)水平上進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)值為蛋白凝膠的綜合評(píng)價(jià)得分。共計(jì)17組實(shí)驗(yàn)，5個(gè)中心點(diǎn)。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels for response surface analysis

1.3.7 數(shù)據(jù)處理及分析

本實(shí)驗(yàn)每個(gè)數(shù)據(jù)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，采用SPSS 16.0軟件分析各個(gè)因素對(duì)凝膠特性的影響程度和顯著性分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 蛋白濃度對(duì)蛋白凝膠特性的影響

由圖1可以看出，蛋白凝膠的保水性、硬度、黏性、彈性均隨著肌原纖維蛋白濃度的升高而顯著升高(P＜0.05)。蛋白凝膠的保水性隨著蛋白濃度的增加而升高是因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)溶解度的增加，高密度蛋白形成的纖維相互交錯(cuò)，從而形成緊密且穩(wěn)定的立體狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［14］。蛋白凝膠硬度主要取決于蛋白在熱誘導(dǎo)條件下相互交聯(lián)的種類和數(shù)量，隨著蛋白濃度的增加，蛋白溶解度升高，蛋白相互交聯(lián)數(shù)量增加，硬度增強(qiáng)。徐幸蓮［15］在研究蛋白質(zhì)濃度對(duì)兔骨胳肌肌球蛋白熱凝膠特性的影響中提出凝膠硬度隨著蛋白濃度的增加而升高，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。

2.1.2 pH值對(duì)蛋白凝膠特性的影響

溶液pH值對(duì)肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響差異極顯著(P＜0.01)。由圖2可知，蛋白凝膠保水性呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，當(dāng)溶液pH值為5和pH值為5.5時(shí)，蛋白凝膠保水性非常低，這是因?yàn)槿芤簆H值靠近肌原纖維蛋白等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)溶解度小。隨著溶液pH值的逐漸升高，蛋白所含靜電荷增加，靜電斥力增加，蛋白質(zhì)束縛水的能力增強(qiáng)，保水性隨之升高。Lyons等［16］提出隨著溶液pH值的升高，肌原纖維蛋白凝膠保水性增加，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖1 蛋白濃度對(duì)凝膠保水性(a)，凝膠質(zhì)構(gòu)特性(b)的影響Fig.1 Effect of protein concentration on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

不同pH條件下，蛋白凝膠硬度差異顯著(P＜0.05)。隨著pH值的增加，蛋白凝膠硬度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是因?yàn)樵谌芤簆H值較低的條件下易于形成細(xì)線型的蛋白凝膠，而當(dāng)溶液pH值較高時(shí)則有利于形成顆粒狀的蛋白凝膠。在不同溶液pH值下，彈性的變化不大，差異不顯著。溶液pH對(duì)蛋白凝膠黏性的影響差異極顯著(P＜0.01)。當(dāng)溶液pH值為7.0時(shí)，形成的蛋白凝膠黏性最大。

圖2 pH值對(duì)凝膠保水性(a)，凝膠質(zhì)構(gòu)特性(b)的影響Fig.2 Effect of pH on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

2.1.3 NaCl對(duì)蛋白凝膠特性的影響

在不同NaCl溶液濃度條件下，蛋白凝膠保水性差異極顯著(P＜0.01)(圖3)。蛋白凝膠保水性隨著NaCl溶液濃度的升高而增加，在NaCl溶液濃度為0.8 mol/L時(shí)，上升趨勢(shì)變緩，與濃度為0.6、1 mol/L時(shí)差異不顯著(P＞0.05)。Bertram 等［17］的研究表明，蛋白凝膠保水性隨溶液離子強(qiáng)度的增加而增加。Chantrapornchai等［18］提出凝膠的保水性，在一定溶液離子強(qiáng)度范圍內(nèi)，隨著鹽溶液濃度的增加而增加，但鹽濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致溶液滲透壓增加，造成蛋白凝膠脫水，凝膠保水性會(huì)有所下降。

凝膠硬度隨著NaCl溶液濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是由于蛋白質(zhì)的溶解度隨著NaCl溶液濃度增加而升高，蛋白交聯(lián)數(shù)量增多，并且溶液中的Na+、Cl－能夠與蛋白表面的電荷中和，從而進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)分子之間的相互作用［19］。蛋白凝膠彈性、黏性的變化趨勢(shì)跟凝膠硬度大致相同，但其最高點(diǎn)分別為NaCl溶液濃度0.8、0.4 mol/L，而后逐漸降低。

圖3 NaCl溶液濃度對(duì)保水性(a)和凝膠質(zhì)構(gòu)特性(b)的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

2.1.4 溫度對(duì)蛋白凝膠特性的影響

不同加熱溫度條件下，形成的蛋白凝膠保水性差異顯著(P＜0.05)(圖4)。在加熱溫度為50℃時(shí)，凝膠保水性很低，這是由于當(dāng)加熱溫度低于55℃時(shí)，蛋白質(zhì)重鏈及頭部不會(huì)形成凝膠結(jié)構(gòu)，只有當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，頭部才能促成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成［20］。在加熱溫度為70℃時(shí)，蛋白凝膠保水性最大，隨著溫度進(jìn)一步升高凝膠保水性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榫奂F(xiàn)象使蛋白網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)破壞，蛋白凝膠失水，凝膠的保水性下降［21］。

圖4 溫度對(duì)凝膠保水性(a)和凝膠質(zhì)構(gòu)特性(b)的影響Fig.4 Effect of heating temperature on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

凝膠硬度隨著溫度的升高，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在溫度為80℃時(shí)硬度達(dá)到最大值，這是因?yàn)榈鞍啄z硬度與蛋白質(zhì)變形有關(guān)，在一定范圍內(nèi)，加熱溫度越高，蛋白質(zhì)變形程度越高，功能基團(tuán)暴露的就越多，凝膠硬度隨之越大［22］。蛋白凝膠黏性和彈性隨著溫度的升高，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，蛋白變形加劇，蛋白凝膠膠黏性下降。

2.2 蛋白凝膠樣品綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)蛋白凝膠的保水性、硬度、彈性和黏性所占的權(quán)重不同，應(yīng)用公式Y(jié)=A×U分別計(jì)算出Box-Behnken實(shí)驗(yàn)中的凝膠綜合評(píng)價(jià)得分。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

表2為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二元多次回歸分析，并建立蛋白凝膠綜合評(píng)價(jià)得分與pH(A)、NaCl濃度(B)、溫度(C)實(shí)際值的數(shù)學(xué)回歸模型 Y=－5.554 1+1.357 7A+1.531 62B+0.025 843C－0.005AB－0.000 2AC－0.003 125BC－0.096 300A2－1.020 62B2－0.000 163 25C2。

分析數(shù)據(jù)，模型P值＜0.000 1，可知模型極顯著;模型的Lack of Fit的P值為0.088 9，大于0.05。說(shuō)明模型可用于實(shí)際值的預(yù)測(cè)，試驗(yàn)方法可靠，能夠滿足響應(yīng)曲面的分析要求。

由表3還可知，蛋白凝膠綜合評(píng)價(jià)得分的回歸方程的回歸系數(shù)R2=0.987 4，表明有98.74%的數(shù)據(jù)可以由此方程解釋。影響蛋白凝膠綜合評(píng)價(jià)得分的一次項(xiàng)主要順序?yàn)锽(極顯著)＞A(不顯著)＞C(不顯著)。交互項(xiàng)中只有BC存在顯著的交互影響，二次項(xiàng)A2、B2影響極顯著。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and response values

2.4 響應(yīng)曲面分析

圖5是響應(yīng)曲面的三維圖。根據(jù)表3可知，BC存在顯著的交互影響，分析BC交互影響的響應(yīng)面圖，隨著NaCl濃度的升高，蛋白凝膠綜合評(píng)價(jià)得分呈先增大后減小的趨勢(shì);而隨作溫度的升高，蛋白凝膠綜合評(píng)價(jià)得分在不同NaCl濃度條件下變化趨勢(shì)不同。在NaCl濃度為0.4 mol/L時(shí)，凝膠綜合評(píng)價(jià)陣隨溫度的升高平緩的升高;在NaCl濃度為0.6 mol/L時(shí)呈先升后下降;而在NaCl濃度為0.8 mol/L時(shí)，溫度對(duì)凝膠綜合評(píng)價(jià)影響很小。

圖5 各相互因素對(duì)蛋白凝膠綜合評(píng)價(jià)得分(Y值)影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Effects of each factor on Y value by response surface analysis

表3 回歸模型系方差分析表Table 3 Analysis of variance for response surface reduced quadratic model

通過(guò)Design-Expert 8.00軟件分析得到蛋白凝膠綜評(píng)價(jià)得分最高可達(dá)到0.543，此時(shí)的各因素的工藝條件為:pH值6.96、NaCl濃度0.63 mol/L、凝膠溫度71.57℃。

采用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為了方便，參數(shù)定為pH 7.0、NaCl濃度0.6 mol/L、凝膠溫度72℃。經(jīng)過(guò)5次平行實(shí)驗(yàn)，最后所得Y值為0.541，與理論值0.543非常接近，可見(jiàn)所確定的模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和模糊數(shù)學(xué)結(jié)合相應(yīng)曲面優(yōu)化法實(shí)驗(yàn)，建立了綜合評(píng)價(jià)鴨肉肌原纖維蛋白凝膠特性的二次多項(xiàng)式模型。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明通過(guò)響應(yīng)曲面確定的該模型是合理的，能夠較好地預(yù)測(cè)蛋白凝膠的綜合性質(zhì)，能夠從Y值對(duì)蛋白凝膠特性進(jìn)行綜合的評(píng)價(jià)。通過(guò)模型分析和實(shí)驗(yàn)修正后得到的最佳工藝參數(shù)是:蛋白濃度 40 mg/mL、pH 7.0、NaCl濃度0.6 mol/L、凝膠溫度72℃。該條件下所制備的凝膠的綜合評(píng)價(jià)得分為0.541。

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