周毅，楊萍，肖前程

1(江西師范大學(xué)高等研究院，江西 南昌，330022)2(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌，330022)

蛋白酶是一種水解酶類，主要用于食品、飼料、紡織、洗滌劑、制革、毛皮、蛋白水解物、果酒及飲料等的澄清，以及醫(yī)藥品、化妝品等的生產(chǎn)和生物材料的提取［1－2］。動(dòng)物、植物以及微生物都可產(chǎn)蛋白酶。其中，微生物是蛋白酶的重要來源，這些微生物包括細(xì)菌和真菌，它們主要來自土壤、海洋和動(dòng)物腸道等［3－12］。雖然運(yùn)用微生物技術(shù)產(chǎn)蛋白酶的研究及應(yīng)用取得了較大進(jìn)展，但是蛋白酶高產(chǎn)菌種的發(fā)現(xiàn)仍然是研究熱點(diǎn)［13－14］。

豬血是一種寶貴的蛋白資源，但因血粉中蛋白質(zhì)口味很差，分子質(zhì)量太大難以被吸收，故目前屠宰行業(yè)中豬血的開發(fā)程度受到了很大的限制，而且周圍環(huán)境還因豬血的隨意排放而遭到了嚴(yán)重污染。而利用蛋白酶能有效降解血粉中的大分子蛋白質(zhì)，大大提高其可吸收性和適口性，制成高營養(yǎng)的動(dòng)物蛋白飼料，并從中提取食用的功能性多肽［15－19］。

近年來，雖然用于飼用和食用的蛋白酶的研究工作已有了很大的進(jìn)展，但蛋白酶種類仍過于單一，尚不足以滿足需求。究其原因主要是由于獲得的菌種酶活力較低，故非常有必要篩選酶活較高的菌株來滿足國內(nèi)日益增長的需求［15－16］。本研究以豬血蛋白為主要營養(yǎng)物質(zhì)，從生豬屠宰場下水道土壤中分離產(chǎn)豬血蛋白降解酶的微生物，并利用豬血脅迫微生物生長的篩選方法挑選具有較高降解能力的菌種，選擇其中產(chǎn)酶活力最高的1株進(jìn)行鑒定并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土樣

采自南昌郊區(qū)3個(gè)不同的屠宰場。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)富集培養(yǎng)基(g/L):豬血10，NaCl 5，瓊脂18，pH值自然。

(2)初篩酪素固體培養(yǎng)基(g/L):酪蛋白10，牛肉膏 3，NaCl 5，K2HPO42，瓊脂 18，pH 7.4。

(3)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，瓊脂 18，pH 7.2。

(4)種子培養(yǎng)液(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.4。

(5)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液(g/L):葡萄糖5，豬血10，KH2PO40.5，MgSO40.3，(NH4)2SO40.3，CaCl21，NaCl 1，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160A型高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;Eppendorf Centrifuge 5427R GMO 2800UV/VIS Spectrophotometer UNICO，PCR產(chǎn)物回收試劑盒:D6492 Omega，離心機(jī) 3K15，Sigma;電泳槽JY-SPFT，PCR 儀，Life Express，博日;電泳儀 JY300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;凝膠成像系統(tǒng)JY04S-3C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 富集與初篩

將從屠宰場取來的土樣，用豬血水溶液澆透并放置于25℃培養(yǎng)箱中數(shù)日，等土樣較為干燥，用10倍稀釋法涂布于富集培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)3 d，挑選出生長非常旺盛的菌株于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)，觀察菌落特征，并初步分類。同時(shí)，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)保存?zhèn)溆?，并將所獲菌株轉(zhuǎn)接至初篩酪素培養(yǎng)基平板37℃培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)接后24 h和48 h，測量透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑比值(DC)。

1.3.2 復(fù)篩

挑取產(chǎn)透明圈的菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)液，37℃，200 r/min，放大搖瓶培養(yǎng)24 h后，按照1∶100的比例將種子液轉(zhuǎn)接至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液，，37℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔6 h取樣，4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清液，測定上清液的蛋白酶活力，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株作為出發(fā)菌株。

1.3.3 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:包括個(gè)體形態(tài)、菌落形態(tài);利用革蘭氏染色法及芽孢染色法對菌體進(jìn)行染色并于顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。

生理生化學(xué)鑒定:包括糖發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［20］的部分經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。

分子生物學(xué)鑒定:以細(xì)菌16S rRNA基因的通用引 物 (F:5 ＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ＇，R:5 ＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇)對擬鑒定菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系為:2×PCR REACTION MIX 25μL，引物(25 pmol/μL)各 1 μL，目標(biāo)菌液 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 20 μL，總體積 50 μL。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃4 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，菌株序列由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司測定。測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站的核酸數(shù)據(jù)庫對比系統(tǒng)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行 Blast比對［21］，并選擇同源性較高的序列用Neighbor-Joining法［22］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 產(chǎn)酶條件的探索

1.3.4.1 種子培養(yǎng)

250 mL的三角瓶裝入50 mL的種子培養(yǎng)基，從平板接入1環(huán)菌，旋轉(zhuǎn)式搖床200 r/min搖瓶培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16～18 h。

1.3.4.2 菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定

于250 mL的三角瓶裝入50 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1%的接種量接入培養(yǎng)16～18 h的菌株B12種子液，旋轉(zhuǎn)式搖床200 r/min搖瓶發(fā)酵，37℃培養(yǎng)，每隔6 h取樣測定酶活力，得到菌種產(chǎn)酶活力曲線。

1.3.4.3 菌株最佳產(chǎn)酶溫度的確定

于250 mL的三角瓶裝入50 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，以1%的接種量接入培養(yǎng)16～18 h的菌株B12種子液，分別在25，30，35，37，40，45 ℃，200 r/min 下振蕩培養(yǎng)24 h后測定產(chǎn)酶情況，確定菌種產(chǎn)酶溫度。

1.3.4.4 培養(yǎng)基初始pH值對菌株B12產(chǎn)酶能力的影響

于250 mL的三角瓶中分別裝入50 mL pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的發(fā)酵培養(yǎng)基，以 1% 的接種量接入培養(yǎng)16～18 h的菌株B12種子液，200 r/min搖瓶發(fā)酵，33℃培養(yǎng)。

1.3.4.5 不同碳源對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

分別配制含有0.5%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、0.5%蔗糖、0.5%甘油、0.5%的乳糖為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，并分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，以1%的接種量接入培養(yǎng)16～18 h的菌株B12種子液，200 r/min搖瓶發(fā)酵，33℃培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)酶情況。

1.3.4.6 不同氮源對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

為了解不同氮源對B12菌株產(chǎn)蛋白酶的影響，分別配制含有 0.5%豬血、KNO3、蛋白胨、(NH4)2SO4、牛肉膏、及酪素為唯一氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，并分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1%的接種量接入培養(yǎng)16～18 h的菌株B12種子液，200 r/min搖瓶發(fā)酵，33℃培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)酶情況。

1.3.5 粗酶液的制備

取發(fā)酵液，在10 000 r/min下冷凍離心20 min，上清液即為蛋白酶粗酶液。

1.3.6 蛋白酶活力測定

取粗酶液適當(dāng)稀釋，取4支試管編號(1號為空白對照)，分別加入酶液1 mL，1號管立即加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，使酶失活，另3支樣品加入1 mL pH 7.0、濃度為2%的酪蛋白底物緩沖液，迅速混勻，并立即放入40℃恒溫水浴，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，保溫10 min后，立即加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，終止反應(yīng)，同時(shí)向1號空白管中加入1 mL 2%酪蛋白底物緩沖液，搖勻，取出離心或過濾除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各試管濾液1 mL，分別移入另4支試管中，再加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5 mL和已稀釋的福林-酚試劑1 mL，搖勻，保溫顯色20 min后，進(jìn)行比色測定(波長660 nm)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酪氨酸含量。

蛋白酶活力定義:1 g固體酶粉(或l mL酶液)，在40℃，pH 7.0，l min內(nèi)水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位，以U/g(U/mL)表示。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

選擇在富集培養(yǎng)基上生長旺盛的菌株點(diǎn)種在酪素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以產(chǎn)生水解透明圈的說明其產(chǎn)蛋白酶，水解透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)越大說明產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。菌株的初篩結(jié)果共獲得可產(chǎn)透明圈的有20株，其中有10株產(chǎn)透明圈較大的菌株，如表1所示。分別命名為B22，B12，B41，B11，B21，B13，B42，B43，B31，B32。其中 B22 所產(chǎn)透明圈直徑和菌落直徑比值最大。

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果(±s，n=3)Table 1 Results of primary screening of 10 protease-producing strains

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果(±s，n=3)Table 1 Results of primary screening of 10 protease-producing strains

菌落編號 透明圈直徑(D)/mm細(xì)菌直徑(d)/mm DC B22 25±0.2 3±0.2 8.3 B12 22±0.2 3±0.2 7.3 B41 19±0.1 3±0.0 6.3 B11 31±0.4 6±0.2 5.2 B21 31±0.4 4±0.1 7.8 B13 20±0.2 3±0.1 6.7 B42 12±0.3 2±0.0 6.0 B43 17±0.4 2.5±0.0 6.8 B31 16±0.3 3±0.0 5.3 B32 12±0.2 2±0.0 6.0

將初篩得到的10株菌株分別接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)每隔6 h測定各發(fā)酵液的蛋白酶活力，將最高處酶活記錄比較，結(jié)果如表2所示，其中B12菌株產(chǎn)的蛋白酶活力最高，綜合水解透明圈和酶活力2個(gè)指標(biāo)，選擇菌株B12為出發(fā)菌株，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株B12的鑒定

菌株B12的形態(tài)學(xué)與部分生理生化鑒定

形態(tài)特征:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上于37℃培養(yǎng)24 h后，產(chǎn)生白色，不透明，表面粗糙，扁平不規(guī)則的菌落。挑取新鮮的菌落，進(jìn)行涂片、固定和革蘭染色，結(jié)果顯示該菌為革蘭陽性細(xì)菌(圖1)。鏡檢觀察為短直桿狀，大小1.0～1.2×3.0～5.0 μm，產(chǎn)芽孢，芽孢呈柱狀，芽孢中生或近中生(圖2)。

表2 產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩Table 2 Results of re-screening of protease-producing strains

圖1 菌株B1革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 The result of B12 Gram staining

圖2 菌株B12芽孢染色結(jié)果Fig.2 The result of B12 spore staining

生化特征:革蘭氏染色呈陽性;V.P試驗(yàn)陽性;M.R試驗(yàn)陽性;吲哚實(shí)驗(yàn)陰性;葡萄糖發(fā)酵陽性;能分解酪素;淀粉水解為陽性;可液化明膠作用于硝酸鹽。根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測結(jié)果，依照伯杰細(xì)菌鑒定手冊［20］，初步認(rèn)為篩選到菌株B12為芽孢桿菌屬。

菌株B12的分子學(xué)鑒定:以菌株B12的總DNA為模板，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)得到1條934 bp的條帶。切膠測序得到16S rDNA序列。將序列在NCBI(National Center for Biotechnol-ogy Information)網(wǎng)站的核酸數(shù)據(jù)庫對比系統(tǒng)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)利用 BLAST進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示同源性較高的菌株為Bacillus cereus.，同源性為99%。采用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果(見圖3)發(fā)現(xiàn)其與2株蠟樣芽孢桿菌聚在一起，且相似度為99%。結(jié)合上述的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)的結(jié)果，初步將該菌株歸屬于蠟樣芽孢桿菌，暫定名為Bacillus cereus.B12。

圖3 基于B12和相關(guān)菌株的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequencesof B12 and related strains

2.3 產(chǎn)酶條件的探索

2.3.1 菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定

不同時(shí)間的產(chǎn)酶量如圖4所示，在發(fā)酵12 h內(nèi)，基本不產(chǎn)蛋白酶;發(fā)酵12 h之后蛋白酶活力迅速提高;發(fā)酵 24 h時(shí)，蛋白酶活力達(dá)最大，為 172.48 U/mL。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酶活力穩(wěn)定在一定數(shù)值。因此，選擇24 h為發(fā)酵周期。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effection of Fermentation time on the protease production

2.3.2 菌株最佳產(chǎn)酶溫度的確定

不同溫度條件下菌株B12的產(chǎn)酶能力如圖5所示。由圖5可見，溫度低于30℃時(shí)酶活增長緩慢，當(dāng)溫度升到30℃之上酶活力較高，溫度為33℃時(shí)酶活最高。但溫度升高到40℃以上酶活迅速降低。因菌株B12屬于蠟樣芽孢桿菌，最適的生長溫度在30～37℃，超過40℃一般不生長，由此可以看出酶活與菌株的種屬有一定的關(guān)系。

圖5 溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effection of temperature on the portease production

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH值對菌株B12產(chǎn)酶能力的影響

不同初始pH值對菌株B12產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，pH值對菌株產(chǎn)酶的影響較大，產(chǎn)酶的最佳pH值為7.0，酶活可以達(dá)172.48 U/mL，在pH值為6以下時(shí)細(xì)菌幾乎不產(chǎn)酶，而pH值高于8時(shí)，酶活亦很低。菌株在初始pH值為5.5～7時(shí)，酶活隨pH值的增大而增大。在pH值為7時(shí)酶活最高，當(dāng)pH值高于7時(shí)酶活隨著pH值的增大而減小，當(dāng)pH值達(dá)到8.5時(shí)，不適應(yīng)菌株的生長，所以酶活幾乎為零。故產(chǎn)酶的最佳pH值為7。

圖6 初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effection of initial pH value on the protease production

2.3.4 不同碳源對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

不同碳源種類對菌株B12產(chǎn)酶能力的影響如圖7所示。由圖7可見添加蔗糖、甘油、可溶性淀粉、葡萄糖作為唯一碳源時(shí)都有利于菌株B12產(chǎn)蛋白酶，其中葡萄糖作為唯一碳源時(shí)最有利于菌株B12產(chǎn)蛋白酶。

2.3.5 不同氮源對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

氮源種類對菌株B12產(chǎn)酶能力的影響如圖8所示。由圖8 可見，添加酪素、(NH4)2SO4、KNO3、牛肉膏、蛋白胨、豬血、酵母粉作為氮源時(shí)都有利于菌株B12產(chǎn)蛋白酶，其中豬血作為唯一氮源時(shí)菌株B12產(chǎn)蛋白酶可達(dá)185 U/mL。

圖7 碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effection of carbon source on the protease production

圖8 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effection of nitrogen source on the protease production

3 討論

本試驗(yàn)以豬血為單一碳源及氮源，以脅迫生長的方式，從屠宰場附近的土壤中篩選得到10株產(chǎn)蛋白酶的菌株，經(jīng)過復(fù)篩酶活力，得到1株產(chǎn)酶能力較高的菌株B12。根據(jù)形態(tài)鑒定，生理生化特性比較和16S rRNA基因序列分析，該菌株歸屬于蠟樣芽孢桿菌，暫定名為Bacillus cereus B12，GenBank中的序列登錄號為ZSHXNEZP015。

從發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的情況來看，該菌株在溫度為33℃時(shí)產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，初始pH值為7.0時(shí)產(chǎn)酶活力最高，該菌在30～37℃及pH 6.5～7.5范圍內(nèi)相對酶活都比較高，說明此菌株所產(chǎn)蛋白酶具有較好的產(chǎn)酶穩(wěn)定性。通過對碳源分析發(fā)現(xiàn)葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油均可作為菌株B12較好的碳源，且葡萄糖對于菌株高效產(chǎn)蛋白酶有利。對氮源分析可以發(fā)現(xiàn)豬血、KNO3、蛋白胨、(NH4)2SO4、牛肉膏、及酪素均可作為菌株B12較好的氮源，而以豬血為唯一氮源時(shí)產(chǎn)酶活力可達(dá)185.48U/mL，說明此菌株產(chǎn)生的蛋白酶能很好地降解豬血蛋白。

已報(bào)道的產(chǎn)蛋白酶種屬有二十多種，由于酶活定義的不同，尚不能對篩選到的所有菌株的蛋白酶活性進(jìn)行比較，但從已公布的報(bào)道來看，本試驗(yàn)篩選的產(chǎn)蛋白酶菌株B12不僅具有較高的產(chǎn)蛋白酶活的能力，還能夠較好地降解豬血蛋白，此菌株若經(jīng)隨后的誘變育種或是基因工程等手段進(jìn)行改造有望進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶能力，有可能為豬血蛋白的高效利用提供技術(shù)支持。

此菌株經(jīng)初步鑒定屬于蠟樣芽孢桿菌，是否會(huì)產(chǎn)毒素還有待于進(jìn)一步研究，若此菌株會(huì)產(chǎn)毒性，則還需進(jìn)一步尋求相關(guān)方法(如基因工程的方法)消除此菌害處，才能使之用于降解豬血獲得相關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的生產(chǎn)當(dāng)中。

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