王威，丁明，宗波，遲蕾

(1 濰坊醫(yī)學院麻醉學系，山東 濰坊 261053； 2 中國人民解放軍第89醫(yī)院麻醉科； 3 中國人民解放軍第89醫(yī)院普外科)

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手術創(chuàng)傷對老齡大鼠認知功能及海馬ApoE表達影響

王威1，丁明2，宗波3，遲蕾1

(1 濰坊醫(yī)學院麻醉學系，山東 濰坊 261053； 2 中國人民解放軍第89醫(yī)院麻醉科； 3 中國人民解放軍第89醫(yī)院普外科)

目的 探討手術創(chuàng)傷對老齡大鼠認知功能及海馬CA1區(qū)載脂蛋白E (ApoE)表達的影響。方法將36只Wistar大鼠按隨機數字表法分為3組，每組12只。正常對照組(C組)腹腔注射生理鹽水；麻醉組(A組)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，不進行手術；手術創(chuàng)傷組(S組)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，待翻正反射消失后行脾切除手術。各組于術前1～5 d、術后1～4 d進行Morris水迷宮實驗，測定認知功能。測試結束后立即處死大鼠，取腦組織，采用免疫組織化學法，檢測海馬CA1區(qū)ApoE的表達。結果 與術前比較，A組術后1 d、S組術后1～3 d逃避潛伏期延長(F=46.108、82.003,q=2.771～14.627,P<0.05)；與C組比較，A組術后1 d、S組術后1～3 d逃避潛伏期延長(F=26.930～119.360,q=6.578～15.450,P<0.05)。與C組比較，S組術后4 d原平臺象限停留時間縮短(F=32.021,q=7.209,P<0.05)，穿越原平臺次數減少(F=16.026,q=5.170,P<0.05)，海馬CA1區(qū)ApoE免疫反應陽性細胞增多(F=9.148,q=4.117,P<0.05)。結論 手術創(chuàng)傷可導致老齡大鼠認知功能減退，其機制可能與海馬中ApoE表達上調有關。

外科手術；創(chuàng)傷和損傷；認知；海馬；載脂蛋白E類；大鼠

術后認知功能障礙(POCD)是指麻醉手術后病人持續(xù)存在的記憶力、抽象思維、定向力障礙，同時伴有社會活動能力的減退，即術后人格、社交能力、認知能力和技巧的變化。自從BEDFORD[1]首次報道老年病人發(fā)生POCD以來，POCD的研究已有50余年，但其原因及發(fā)生機制仍不清楚。隨著人口老齡化的不斷加劇，老年病人POCD越來越受到重視，POCD增加病人住院時間和醫(yī)療費用，并導致病人社會活動能力減退，嚴重影響生活質量[2]。載脂蛋白E(ApoE)是一種含精氨酸較多的多態(tài)性糖蛋白[3],在神經系統(tǒng)的正常生長過程及損傷后修復中發(fā)揮作用[4]。本研究擬評價脾切除手術后大鼠認知功能與ApoE表達的變化，為研究POCD的發(fā)生機制提供參考。

1 材料與方法

1.1動物分組及處理

雄性Wistar大鼠36只，18～20月齡，體質量500～600 g，由山東魯抗動物藥業(yè)有限公司提供。大鼠適應性飼養(yǎng)1周，自由攝食飲水。實驗前禁食12 h，自由飲水。按隨機數字表法，將大鼠隨機分為3組，每組12只。正常對照組(C組)腹腔注射生理鹽水2.5 mL/kg；麻醉組(A組)腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉2.5 mL/kg麻醉；手術創(chuàng)傷組(S組)腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉2.5 mL/kg，待翻正反射消失后右側臥位固定，剃毛，皮膚消毒，在肋緣下和脊柱旁各1 cm交點處作1.5～2.0 cm豎切口，進入腹腔游離脾臟，在脾蒂遠端根部用3號絲線結扎脾動靜脈，完全摘除脾臟并確定無副脾殘留,徹底止血后用碘附消毒切口，0號線逐層關腹，術畢切口周圍注射布比卡因10 mg/kg局部鎮(zhèn)痛。

1.2認知功能測試

應用Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)實驗檢測大鼠認知功能。在實驗開始前1 d對大鼠進行訓練和篩選，將大鼠小心放入水迷宮中自由游泳，讓其適應實驗環(huán)境，淘汰有顯著運動障礙和經過反復訓練仍然找不到平臺的大鼠。各組大鼠于術前5 d開始行定位航行實驗，連續(xù)5 d，第5天的成績作為術前測試結果。術后1 d繼續(xù)進行定位航行實驗，連續(xù)3 d。每天于相同時間點進行測試，依次從各象限池壁中點將大鼠面向池壁放入水中，從入水到找到隱蔽平臺的時間即為本次逃避潛伏期；在平臺停留10 s后休息15 min，再將其從另一象限放入水中找尋平臺；若120 s內未找到平臺則將其引導至平臺上，時間記錄為120 s。每只大鼠取4個象限平均值作為當天的測試結果?？臻g探索實驗：術后4 d，將平臺撤除，從與平臺相應的象限放入大鼠，記錄其120 s內在原平臺象限停留時間及穿過原平臺次數。

1.3海馬CA1區(qū)ApoE表達水平的測定

認知功能測試完成后，各組隨機取3只大鼠，腹腔注射20 g/L水合氯醛2.5 mL/kg，待翻正反射消失后剪開胸腹充分暴露心臟和肝臟，迅速將導管經左心室插入主動脈，絲線固定導管后剪開右心耳。先以約200 mL生理鹽水快速灌注，至肝臟完全變白，更換40 g/L的多聚甲醛繼續(xù)灌注30 min，斷頭取腦組織，置40 g/L的多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機冠狀切片，片厚5 μm。采用免疫組織化學SP法染色測定海馬CA1區(qū)ApoE的表達水平。在Leica DM-1000型光學顯微鏡下拍攝，每例標本選取5張切片，在每張切片上隨機選取3個不重復的視野，采用Imagepro plus圖像處理系統(tǒng)，測出每個視野下陽性細胞的個數，取其

平均值。

1.4統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1Morris水迷宮實驗

與術前相比較,A組術后1 d、S組術后1～3 d逃避潛伏期延長(F=46.108、82.003,q=2.771～14.627,P<0.05)，C組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與C組比較，A組術后1 d、S組術后1～3 d逃避潛伏期延長(F=26.930～119.360,q=6.578～15.450,P<0.05)。與C組比較，S組術后4 d原平臺象限停留時間縮短(F=32.021,q=7.209,P<0.05)，穿越原平臺次數減少(F=16.026,q=5.170,P<0.05)。見表1、2。

2.2海馬組織ApoE表達

光鏡下見細胞質或核膜上染色呈棕褐色者為ApoE免疫反應陽性細胞。S組海馬CA1區(qū)ApoE免疫反應陽性的細胞較C組增多(F=9.148,q=4.117,P<0.05)，而A組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠不同時間水迷宮實驗逃避潛伏期的比較

表2 各組大鼠原平臺象限停留時間、穿過原平臺次數及海馬CA1區(qū)ApoE表達的比較

3 討 論

大量研究證實，老齡是惟一明確的POCD危險因素[5-6]，年齡>65歲老年病人POCD發(fā)病率是年輕人6～10倍[7]，故本文以老齡大鼠為研究對象。

為避免感染因素對實驗結果的影響，術中嚴格無菌操作，并在文獻報道的大鼠脾切除方法的基礎上[8]，對切口位置進行改良,由原來的仰臥位在肋緣下腹中線偏左1 cm處切口，改良為右側臥位于肋緣下和脊柱旁各1 cm交點處做1.5～2.0 cm豎切口。改良后的方法既可使脾臟容易暴露，又便于水迷宮測試時用防水貼膜貼附和每天切口的消毒。

Morris水迷宮實驗能較客觀地評價空間學習記憶能力，是經典的行為學研究方法[9]。為排除時間、光照、溫度等因素對實驗結果的影響，本研究每天于相同時間段進行實驗，保持光照和水溫的恒定。隨著訓練天數的增加，大鼠的逃避潛伏期時間逐漸縮短，說明大鼠有一個學習和記憶的過程。與術前和對照組相比較，手術組術后1～3 d逃避潛伏期時間延長、原平臺象限停留時間縮短、穿過原平臺次數減少，說明手術創(chuàng)傷影響了大鼠的認知能力；麻醉組術后1 d的逃避潛伏期時間延長，說明戊巴比妥鈉麻醉對大鼠的認知功能有一過性的抑制作用，可能是戊巴比妥鈉在體內未代謝完產生的影響[10]。

手術創(chuàng)傷后所致的急性應激可導致神經膠質細胞，尤其是星形細胞出現功能紊亂，引起不良的神經元-膠質細胞相互作用，致神經元損害[11]。中樞神經系統(tǒng)中的ApoE主要產生于星形膠質細胞[12]，參與腦組織中脂質代謝及神經元網絡維持和神經細胞的修復再生。目前，手術創(chuàng)傷后導致ApoE的表達增多原因尚不清楚，可能是由于手術應激致神經元受損，ApoE在損傷的神經元周圍大量聚集修復阻礙了神經傳導通路有關。

綜上所述，手術創(chuàng)傷可影響老齡大鼠的認知功能，其機制可能與海馬組織中ApoE表達上調有關。

[1] BEDFORD P D. Adverse cerebral effects of anesthesia on old people[J]. Lancet, 1955,269(6684):259-263.

[2] STEINMETZ J, CHRISTENSEN K B, LUND T, et al. Long-term consequences of postoperative cognitive dysfunction[J]. Anesthesiology, 2009,110(3):548-555.

[3] SHELBURNE F, QUARFORDT S H. A new apoprotein of human plasma very low density lipoproteins[J]. J Chem, 1974,249(5):1428-1433.

[4] SCHELLENBERG G D, BOEHNKE M, WIJSMAN E M, et al. Genetic association and linkage analysis of the apolipoprotein CⅡ locus and familial Alzheimer’s disease[J]. Annals of Neurology, 1992,31(2):223-227.

[5] RASMUSSEN L S. Postoperative cognitive dysfunction: incidence and prevention[J]. Best Practice & Research Clinical Anaesthesiology, 2006,20(2):315-330.

[6] MONK T G, WELDON B C, GARVAN C W, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery[J]. Anesthesiology, 2008,108(1):18-30.

[7] SILVERSTEIN J H, TIMBERGER M, REICH D L, et al. Central nervous systerm dysfunction after noncardiac surgery and anesthesia in the elderly[J]. Anesthesiology, 2007,106(3):622-628.

[8] 徐靜,萬燕杰,曾因明. 脾切除術對大鼠空間學習記憶能力的影響[J]. 中華麻醉學雜志, 2006,26(2):144-147.

[9] POUZET B, ZHANG W N, FELDON J, et al. Hippocampal lesioned rats are able to learn a spatial position using non-spatial strategies[J]. Behavioural Brain Research, 2002,133(2):279-291.

[10]王紅梅,耿德勤,譚迎春,等. 麻醉與手術創(chuàng)傷對不同月齡大鼠認知功能的影響[J]. 中國行為醫(yī)學科學, 2003,12(6):17-18.

[11]YANG G Y, BETZ A L, HOFF J T. The effects of blood or plasma clot on brain edema in the rat with intracerebral he-morrhage[J]. Acta Neurochirurgica Supplement, 1994,60:555-557.

[12]KOOB A O, PAULINO A D, MASLIAH E. GFAP reactivity, apolipoprotein E redistribution and cholesterol reduction in human astrocytes treated with alpha-synuclein[J]. Neuroscience Letters, 2010,469(1):11-14.

(本文編輯 馬偉平)

EFFECTS OF SURGICAL TRAUMA ON COGNITIVE FUNCTION AND EXPRESSION OF APOE IN HIPPOCAMPUS OF AGED RATS

WANGWei,DINGMing,ZONGBo,CHILei

(Department of Anesthesiology, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo explore the effects of surgical trauma on cognitive function and expression of Apolipoprotein E (ApoE) in the hippocampal CA1 area of aged rats.MethodsThirty-sixWistarrats were evenly randomized to three groups as control group (Group C), anesthesia group (Group A) and surgical trauma group (Group S). The rats in the group C were given intraperitoneal injection of normal saline, those in group A were anesthetized using intraperitoneal injection of pentobarbital sodium, no operation was performed, for those in group S, intraperitoneal pentobarbital-sodium-anesthesia was given and a splenectomy performed. Morris water maze experiment was carried out to assay cognition function 1-5 days before and 1-4 days after surgery. The rats were sacrificed upon completion of the test, the brain tissues were taken for detection of ApoE expression in hippocampal CA1 area using immunohistochemical method.ResultsCompared with pre-operation, the escape latent period was increased one day after surgery in group A, and one to three days in group S (F=46.108,82.003;q=2.771-14.627;P<0.05); Compared with group C, the escape latent period in group A increased one day after surgery, and that in group S increased one to three days after (F=26.930-119.360,q=6.578-15.450,P<0.05). A comparison between group C and group S showed that, four days after surgery, the period of rat staying in the pristine quadrant in group S shortened (F=32.021,q=7.209,P<0.05), the number of times traversing terrace decreased (F=16.026,q=5.170,P<0.05), and the number of positive ApoE immunoreactive cells in hippocampal CA1 area increased (F=9.148,q=4.117,P<0.05).ConclusionSurgical trauma may result in cognitive dysfunction in aged rats, its mechanism is likely to be related with up-regulation of ApoE expression in hippocampus.

surgical procedures, operative; wounds and injuries; cognition; hippocampus; apolipoproteins E; rats

2014-11-17;

2015-02-15

王威(1987-)，男，碩士研究生。

丁明(1966-)，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師。

R619.5

A

1008-0341(2015)03-0300-03