石源源，韓璐，舒君，王笑峰，羅兵

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，山東 青島 266021)

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TLR9-1486和TLR9-2848基因多態(tài)性與胃癌易感性關(guān)系

石源源，韓璐，舒君，王笑峰，羅兵

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，山東 青島 266021)

目的 探討Toll樣受體9 (TLR9)編碼基因TLR9-1486和TLR9-2848位點(diǎn)多態(tài)性以及EB病毒(EBV)感染與胃癌易感性的關(guān)系。方法 選取131例胃癌病人為研究對(duì)象，包括43例EBV相關(guān)胃癌(EBVaGC)和88例EBV陰性胃癌(EBVnGC)，同時(shí)隨機(jī)抽取66例健康人外周血標(biāo)本作為對(duì)照。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測TLR9基因-1486位點(diǎn)T/C和-2848位點(diǎn)G/A多態(tài)性。結(jié)果 TLR9-1486T/C位點(diǎn)多態(tài)性分析顯示，胃癌組和對(duì)照組3種基因型分布和等位基因頻率比較差異無顯著性(P>0.05)；EBVaGC組和EBVnGC組中各基因型分布和等位基因頻率差異也無顯著性(P>0.05)；與攜帶T等位基因者相比較，C等位基因攜帶者胃癌和EBVaGC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯升高趨勢。TLR9-2848G/A位點(diǎn)多態(tài)性分析顯示，胃癌組和對(duì)照組3種基因型分布和等位基因頻率差異無顯著性(P>0.05)；EBVaGC組和EBVnGC組中各基因型分布和等位基因頻率差異也無顯著性(P>0.05)；與G等位基因攜帶者比較，A等位基因攜帶者胃癌和EBVaGC易感性無明顯升高。結(jié)論 TLR9-1486和TLR9-2848位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌易感性無關(guān)，且在EBVaGC發(fā)生中與EBV感染無協(xié)同關(guān)系。

胃腫瘤；Toll樣受體9；多態(tài)性,單核苷酸；皰疹病毒4型,人

EB病毒(EBV)是傳染性單核細(xì)胞增多癥病原體，同時(shí)又與多種人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金病、移植后淋巴瘤、鼻咽癌以及部分胃癌[1-2]。Toll樣受體(TLR)是Ⅰ型跨膜蛋白受體，在啟動(dòng)天然免疫和調(diào)節(jié)特異性免疫中起重要作用，TLR信號(hào)調(diào)節(jié)異?？蓪?dǎo)致慢性炎癥性疾病和

癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)增加[3-4]。相關(guān)研究已表明，TLRs編碼基因多態(tài)性可能增加罹患某些腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[5]。如TLR9-1486T/C (rs187084)和TLR9-2848G/A (rs352140)位點(diǎn)多態(tài)性可影響TLR9轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)編碼，進(jìn)而影響其功能，并參與自身免疫性疾病和癌癥的發(fā)生[6-7]。目前尚未見TLR9上述位點(diǎn)多態(tài)性與EBV相關(guān)胃癌(EBVaGC)相關(guān)性的研究報(bào)道。本研究選取EBVaGC、EBV陰性胃癌(EBVnGC)病人作為研究對(duì)象，探討TLR9編碼基因1486T/C和2848G/A位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌發(fā)生的關(guān)系，以及EBV感染與TLR9基因多態(tài)性是否在EBVaGC發(fā)生中具有協(xié)同關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院收治的經(jīng)病理檢查確診的胃癌病人131例作為胃癌組，采用原位雜交檢測石蠟組織切片中EBV編碼的小分子非多聚腺苷酸EBER1的表達(dá)來篩選EBVaGC，篩選出EBVaGC者43例和EBVnGC者88例。同時(shí)，選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院健康查體者66例作為對(duì)照組(均為非腫瘤病人，并排除各種感染及自身免疫病)，性別和年齡與胃癌組差異無顯著性。采集兩組空腹EDTA抗凝靜脈血5 mL，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。

1.2組織細(xì)胞DNA提取

新鮮的胃癌組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA提取采用酚-氯仿-異戊醇法，石蠟包埋的胃癌組織DNA提取采用德國QIAGEN公司的QIAAmp FFPE DNA 提取試劑盒，操作參照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3TLR9編碼基因1486T/C和2848G/A位點(diǎn)多態(tài)性檢測

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分別分析TLR9基因1486T/C和2848G/A兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性，所用引物序列和產(chǎn)物大小見表1。

表1 TLR9編碼基因多態(tài)性分析所用引物序列及產(chǎn)物大小

TLR9編碼基因1486T/C和2848G/A位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增條件相同，反應(yīng)體系為30 μL，包括10×Buffer 3 μL，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，DNA 模板2 μL。循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取6 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠(0.5 mg/L)的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。每次PCR反應(yīng)均用無菌雙蒸水作陰性對(duì)照。

采用限制性內(nèi)切酶AflⅡ(New England Biola-bs Inc., Ipswich, MA, USA)酶切1486T/C位點(diǎn)長565 bp的PCR產(chǎn)物，酶切體系20 μL，包括10×NEB緩沖液2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL, 100×BSA0.2 μL, AflⅡ 0.5 μL，無酶雙蒸水7.3 μL。混勻后瞬時(shí)離心，37 ℃水浴1 h。限制性內(nèi)切酶BstUⅠ酶切2848G/A位點(diǎn)長360 bp的PCR產(chǎn)物，酶切體系為20 μL，包括10×NEB緩沖液 2 μL，BstUⅠ 0.5 μL，DNA 10 μL，無酶雙蒸水7.5 μL?；靹蚝笏矔r(shí)離心，60 ℃水浴1 h。上述酶切產(chǎn)物于含溴化乙錠(0.5 mg/L)的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4PCR產(chǎn)物測序

將上述部分經(jīng)過PCR-RFLP鑒定分型的產(chǎn)物45 μL送北京華大基因有限公司進(jìn)行序列測定，測序后用Chromas軟件查看峰圖文件，DNAStar軟件(Larsergene,version 7.0)進(jìn)行序列剪接和對(duì)比分析，并與相應(yīng)TLRs野生型序列進(jìn)行比對(duì)以驗(yàn)證PCR-RFLP結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間基因型、等位基因、等位基因攜帶者比較采用pearsonχ2檢驗(yàn)，基因多態(tài)性與胃癌相關(guān)性用非條件Logistic回歸分析，計(jì)算比值比(OR)，以雙側(cè)a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1TLR9編碼基因1486T/C位點(diǎn)多態(tài)性檢測

本文131例胃癌組織DNA和66例對(duì)照組外周血DNA均擴(kuò)增出TLR9基因1486T/C位點(diǎn)565 bp特異性條帶，PCR產(chǎn)物Afl Ⅱ酶切后電泳條帶仍為565 bp者為純合突變CC基因型；酶切后出現(xiàn)416 bp和149 bp兩條帶者為純合野生TT基因型；觀察到416 bp、149 bp和565 bp共3條帶者，則為雜合CT基因型。部分標(biāo)本酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

M為DL 2000 DNA Marker；①、、、、為CC基因型；②～④、⑥、⑧～⑩、、、、為CT基因型；⑤、⑦、、、、、、為TT基因型。

隨機(jī)選取不同基因型PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果采用DNAStar軟件與GenBank TLR9標(biāo)

準(zhǔn)型(野生型)DNA序列進(jìn)行比較，其結(jié)果與PCR-RFLP鑒定結(jié)果一致。

胃癌組和對(duì)照組3種基因型分布和等位基因頻率比較差異無顯著意義(P>0.05)。EBVaGC組和EBVnGC組各基因型分布和等位基因頻率差異也無顯著性(P>0.05)。單自變量非條件Logistic回歸分析(攜帶C等位基因者賦值為0,攜帶T等位基因者賦值為1)顯示，胃癌組與對(duì)照組中，與攜帶T等位基因者相比較，攜帶C等位基因者有增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的趨勢，但差異無顯著意義(OR=1.231，95%CI=0.646～2.346，P>0.05)；EBVaGC組與EBVnGC組中差異也無顯著性(OR=0.969，95%CI=0.429～2.188，P>0.05)。見表2。

2.2TLR9編碼基因2848G/A位點(diǎn)多態(tài)性檢測

本文131例胃癌組織DNA和66例對(duì)照組外周血DNA均擴(kuò)增出360 bp特異性條帶，以酶切產(chǎn)物電泳條帶仍為360 bp者為純合突變AA基因型；酶切產(chǎn)物電泳出現(xiàn)227 bp和133 bp兩條帶者為純合野生GG基因型；酶切產(chǎn)物電泳觀察到227 bp、133 bp和565 bp共3條帶者則為雜合GA基因型。部分標(biāo)本PCR產(chǎn)物BstUⅠ酶切后電泳結(jié)果見圖3。同上方法對(duì)3種基因型PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，其結(jié)果與PCR-RFLP檢測結(jié)果一致。

M為DL 2000 DNA Marker；①、③、⑥、⑩、、、為GA基因型；②、④、、、、為GG基因型；⑤、⑦～⑨,、、、～為AA基因型。

胃癌組和對(duì)照組3種基因型分布和等位基因頻率比較差異無顯著意義(P>0.05)。EBVaGC組和EBVnGC組各基因型分布和等位基因頻率差異也無顯著性(P>0.05)。單自變量非條件Logistic回歸分析(攜帶G等位基因者賦值為0，攜帶A等位基因者賦值為1)顯示，胃癌組與對(duì)照組中，與攜帶G等位基因者相比，攜帶A等位基因者與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性(OR=0.985，95%CI=0.524～1.848,P>0.05)；EBVaGC組與EBVnGC組中差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.664，95%CI=0.298～1.480,P>0.05)。見表3。

表2 TLR9-1486T/C基因型和等位基因分布

表3 TLR9-2848G/A基因型和等位基因分布

3 討 論

人類TLR家族已發(fā)現(xiàn)有11個(gè)成員，而目前研究最多的則是TLR2、3、4和9，其中TLR9在許多腫瘤組織中高表達(dá)，TLR9-1486T/C(rs187084)和TLR9-2848G/A(rs352140)位點(diǎn)多態(tài)性可能會(huì)影響TLR9基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)編碼。本研究結(jié)果表明，TLR9編碼基因1486T/C和2848G/A位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌的發(fā)病易感性無關(guān)，而且與EBV感染在胃癌發(fā)病易感性中也無協(xié)同關(guān)系。曾紅梅等[8]自胃癌高發(fā)區(qū)山東臨朐縣選取248例胃癌病人，同時(shí)隨機(jī)抽取496例胃炎病人作為對(duì)照，采用PCR-RFLP技術(shù)證實(shí)TLR2基因rs3804099位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，并與幽門螺桿菌感染存在協(xié)同效應(yīng)；而TLR9基因rs187084位點(diǎn)多態(tài)性則與胃癌和幽門螺桿菌無相關(guān)性。WANG等[9]從江蘇漢族人群中選取314例胃癌病人和314例健康對(duì)照者，采用PCR-RFLP技術(shù)檢測分析，結(jié)果顯示江蘇省漢族人群中攜帶TLR9-1486T/C基因C等位基因者胃癌的易感性增加，攜帶C等位基因和幽門螺桿菌感染在胃癌發(fā)生發(fā)展中有協(xié)同作用。這些結(jié)果不同的原因仍不清楚，可能是地區(qū)差異造成遺傳背景不同所致，也可能與幽門螺桿菌和EBV是不同的感染因子有關(guān)。LAI等[7]采用PCR-RFLP方法，對(duì)取自四川省華西第二醫(yī)院的120例宮頸癌和100例對(duì)照者進(jìn)行檢測分析，證明宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)與TLR9-2848G/A位點(diǎn)多態(tài)性有明顯的關(guān)系，但與TLR9-1486T/C位點(diǎn)多態(tài)性無相關(guān)關(guān)系。還有研究表明，TLR9基因多態(tài)性與前列腺癌及子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，提示TLR9基因多態(tài)性在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用可能有所不同[10-11]。

有研究表明，TLR9具有識(shí)別EBV以及產(chǎn)生先天免疫反應(yīng)的能力，這可能有助于限制病毒的傳播以及控制EBV潛伏感染B細(xì)胞的增殖；另一方面，EBV可能會(huì)干擾TLR9表達(dá)和功能，從而影響宿主免疫反應(yīng)有助于病毒的長期生存。FATHALLAH等[12]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測并比較初始B細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞系的TLR9表達(dá)水平，證明EBV潛伏膜蛋白(LMP1)可明顯抑制TLR9轉(zhuǎn)錄，降低TLR9 mRNA和蛋白質(zhì)的水平，LMP1通過下調(diào)TLR9的轉(zhuǎn)錄來逃避先天免疫反應(yīng)。由于EBVaGC中EBV屬于 Ⅰ 型潛伏，并不表達(dá)LMP1，所以不存在上述抑制作用。因此，尚需在上述研究基礎(chǔ)上對(duì)TLR9編碼基因其他多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，增加胃部慢性炎癥病人作為病例對(duì)照，同時(shí)注意外界環(huán)境和宿主因素對(duì)胃癌形成的影響，進(jìn)一步明確TLR9基因多態(tài)性和EBV感染與胃癌以及EBVaGC易感性的關(guān)系。

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(本文編輯 馬偉平)

RELATIONSHIP BETWEEN GENE TLR9-1486 AND TLR9-2848 POLYMORPHISMS AND EBVAGC SUSCEPTIBILITY

SHIYuanyuan,HANLu,SHUJun,WANGXiaofeng,LUOBing

(Department of Medical Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between toll-like receptor 9 encoding gene TLR9-1486 and TLR9-2848 site polymorphisms and EBV infection and gastric cancer susceptibility.MethodsThis study consisted of 131 patients with gastric cancer including 43 cases of EBV-associated gastric carcinoma (EBVaGC) and 88 cases of EBV-negative gastric carcinoma (EBVnGC), and peripheral blood specimens taken from 66 healthy individuals served as controls. TLR9 gene-1486 site T/C and -2848 site G/A polymorphism were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP).ResultsTLR9-1486T/C site polymorphism analysis showed there was no significant difference in genotype frequency and allele frequency in gastric cancer group and the control group (P>0.05). There was also no significant difference in each of genotype distribution and allele frequency between EBVaGC group and EBVnGC group (P>0.05). Compared with T allele, the frequency of C allele had no apparently increased risk trend for gastric cancer and EBVaGC. TLR9-2848 site G/A polymorphism analysis showed that there was no significant difference in genotype distribution and allele frequency between gastric cancer group and the control group (P>0.05), and there was also no significant difference in each of genotype distribution and allele frequency between EBVaGC group and EBVnGC group (P>0.05). Compared with G allele, the frequency of A allele showed no obvious risk for gastric cancer and EBVaGC susceptibility.ConclusionTLR9 gene-1486 and-2848 site polymorphism are not associated with gastric cancer, and there is no collaborative relationship with EBV infection in the carcinogenesis of EBVaGC.

stomach neoplasms; toll-like receptor 9; polymorphism, single nucleotide; herpesvirus 4, human

2014-07-20;

2015-01-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30970157)、青島市科技局資助項(xiàng)目(13-1-3-50-jch)

石源源(1985-),女,碩士研究生。

羅兵(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。

R735.2

A

1008-0341(2015)03-0260-04