劉俊斌，吳衛(wèi)紅，靳君華

(內蒙古醫(yī)科大學 附屬醫(yī)院 肝膽外科，內蒙古 呼和浩特010050)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌，近年來，抑癌基因的失活在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用愈來愈受到重視。Runt 相關轉錄因子3(runt related transcription factor 3，Runx3)是Runt 結構域轉錄因子家族成員，是一種新的抑癌基因，廣泛表達于消化道上皮細胞、血液細胞及神經細胞等[1]。Runx3基因與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的系，在人類多種腫瘤的發(fā)病過程中起著重要的作用[2]，因而受到國內外學者的廣泛關注。Runx3基因與腫瘤的相關性研究主要集中于胃癌，研究表明Runx3基因作為一種新近發(fā)現的抑癌基因，其表達下調參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展[3]。前期有研究表明腫瘤抑制因子Runx3 可以抑制胃黏膜上皮細胞的增殖，促進細胞的凋亡[4]。Runx3基因與肝癌的相關研究主要從甲基化、雜合缺失進行[5-6]，而Runx3 在肝細胞癌中的作用及其機制如何，目前國內外研究報道尚少。因此，本研究探討Runx3基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及意義，為肝癌發(fā)病機制的研究和腫瘤的基因治療提供理論依據和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

新生牛血清(fetal bovine serum，FBS)(華美生物工程有限公司);Trizol 試劑(Gibco);轉染試劑LipofetamineTM2000(Invitrogen 公司);MTT(Sigma公司)，AV/PI 雙染凋亡檢測試劑盒(BD 公司);Transwell 膜(Millipore 公司)。Runx3 和內參基因β-actin的引物序列(上海生工公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):人肝癌細胞系HepG2(中科院上海細胞所)，由本實驗室保存。肝癌HepG2細胞以單層細胞貼壁的增殖方式培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱，每1～2 天換液1次。

1.2.2 Runx3基因siRNA 序列的設計及轉染:siRNA 片段由上海生工合成。靶向Runx3的siRNA 序列為:5'-GATCCGTCGGAACTGAACCCATTCTTTCAA GAGAAGAATGGGTTCAGTTCCGAGGTTTTTTGGAAA-3'(正向)和5'-AGCTTTTCCAAAAAACCTCGGAAC TGAACCCATTCTTCTCTTGAAAGAATGGGTTCAGTT CCGACG-3'(反向)。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質體復合物，實驗組加入Runx3-siRNA 混合物，同時設置對照組(control)。將人肝癌HepG2細胞以每孔2×105個接種于6孔板，待細胞增殖至70%～80%時，更換無血清培養(yǎng)基，采用LipofetamineTM2000 將Runx3-siRNA轉染細胞。

1.2.3 RNA 提取與qRT-PCR:采用Trizol 試劑提取HepG2細胞總RNA，按照試劑盒要求操作。Runx3 上游引物序列:5'-AGGCATTGCGCAGCTCAG CGGAGTA-3'，下游引物序列:5'-TCTGCTCCGTGCT GCCCTCGCACTG-3'，檢測按實驗室常規(guī)方法進行PCR擴增。以β-actin 為內參，依據2－ΔΔCT法計算各組細胞mRNA的相對表達量。

1.2.4 Western blot:提取細胞總蛋白，常規(guī)方法進行蛋白免疫分析。每個樣品取40 μg 蛋白進行常規(guī)SDS-PAGE 電泳，蛋白濃度采用BCA 試劑盒測定。經電泳后轉移至PVDF膜，10%脫脂奶粉4℃封閉PVDF膜過夜，加10%脫脂奶粉稀釋好的一抗加于膜上，室溫反應60 min;用TBST 緩沖液洗膜10 min×3次;加二抗37℃孵育45 min，TBST 緩沖液洗膜10 min×3次，滴加ECL 試劑，將PVDF膜放入X 片暗盒，在暗室中壓片，顯影。以β-actin 作為內參。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖:轉染后6 h，將細胞按組轉接種到無菌的96孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 換液1次。實驗分為空白對照組，脂質體組，NC-siRNA組和Runx3-siRNA組。待轉染后24、48、72和96 h 分別進行MTT 檢測。取出培養(yǎng)板，0.25%胰蛋白酶消化各組細胞，吸去胰蛋白酶，加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)60 min。每孔加入MTT 溶液(5 μg/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后進行比色測定，酶聯免疫檢測儀在490 nm 波長下讀取A490值。每組實驗重復3次。

1.2.6 Annexin V/PI 檢測細胞凋亡:實驗分組同上，轉染后48 h，收集各組細胞并行細胞凋亡檢測，具體操作方法參照試劑盒說明書進行。

1.2.7 Transwell 檢測細胞的侵襲能力:實驗分組同上，將培養(yǎng)的人肝癌HepG2細胞消化成單細胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗3次，將細胞懸液調整成2×105個/mL備用。預先將Matrigel(提前12 h)用無血清培養(yǎng)基DMEM 稀釋成1∶3濃度，均勻地鋪滿Transwell 小室上室的聚碳酸酯膜，室溫放置1 h，使Matrigel 凝固形成基質膜。Transwell 下腔室加入700 μL含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，小室內接種200 μL無血清細胞懸液，培養(yǎng)18 h后取出Transwell膜，預冷的PBS 洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色5～10 min，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計穿過Transwell 膜的細胞數。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行t 檢驗及單因素方差分析，數據以平均數±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 Runx3轉染效果鑒定

轉染效果(圖1A)對照組、脂質體組和NC-siRNA組中Runx3的mRNA表達水平無明顯差異，相比而言，Runx3-siRNA組mRNA表達水平明顯下降(P＜0.05)。對照組、脂質體組和NC-siRNA組中Runx3 蛋白條帶吸光度基本一致(圖1B)，與其相比，Runx3-siRNA組條帶吸光度明顯減弱(P＜0.05)(圖1C)。

圖1 Runx3轉染效果Fig1 The transfection effect of Runx3

2.2 Runx3對HepG2細胞增殖的影響

對照組、脂質體組和NC-siRNA組在轉染后各個時間點上的A490nm值無顯著性變化。而與各組相比，Runx3-siRNA轉染后HepG2細胞增殖活力下降，轉染后第3天細胞增殖活力降低較為明顯(P＜0.05)(圖2)。

圖2 Runx3對HepG2細胞增殖的影響Fig2 Effect of Runx3 on HepG2 cells proliferation

2.3 Runx3對HepG2細胞凋亡的影響

轉染48 h后，對照組、脂質體組和NC-siRNA組細胞凋亡率分別是(12.1%)、(12.0%)和(12.3%)，無差異，而Runx3-siRNA組可以顯著促進HepG2細胞的凋亡(29.9%)(圖3)。

圖3 Runx3對HepG2細胞凋亡的影響Fig3 Effect of Runx3 on HepG2 cell apoptosis

2.4 Runx3對HepG2細胞侵襲能力的影響

與對照組、脂質體組和NC-siRNA組相比，Runx3-siRNA轉染后細胞的侵出小室數目明顯降低(P＜0.05)(圖4)。

圖4 Runx3對HepG2細胞侵襲的影響Fig4 Effect of Runx3 on HepG2 cells invasion

3 討論

許多研究表明，Runx3基因在胃癌、結腸癌、膽道腫瘤、肺癌等人類多種腫瘤中存在啟動子區(qū)域甲基化異常[7-9]，在肝癌中也有報道[10-11]，這是抑癌基因Runx3 失活的主要機制。肝癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多途徑、多階段共同作用的結果，與多種癌基因和抑癌基因變化有關。Runx3基因是哺乳動物中Runx 家族的進化基礎，是近年來發(fā)現的一種新型抑癌基因[12]，可能在肝癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Runx3 蛋白在TGF-介導的細胞周期調控、細胞分化與凋亡過程中發(fā)揮重要作用[13]。肝細胞癌存在Runx3的高甲基化[14]，提示Runx3基因在肝細胞癌中可能是一個關鍵性的腫瘤抑制基因。據報道，原發(fā)性肝癌存在著嚴重的TGF-β 信號傳導障礙，這說明Runx3基因可能在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中是關鍵性的腫瘤抑制基因，其功能失活可導致TGF-β/SMADS 信號通路削弱[15]。但是，關于Runx3 在肝癌HepG2細胞發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未見報道。本研究通過siRNA下調肝癌HepG2細胞中Runx3基因的表達，發(fā)現HepG2細胞增殖活力和侵襲能力均明顯下降，凋亡增加，表明Runx3 與抑制肝癌細胞增殖、侵襲和促進調亡有一定關系，提示Runx3 在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，為肝癌的發(fā)病機制的進一步探索和基因靶向治療的研究提供理論依據。

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