陳 健，紀志剛*，劉廣華，周 立

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院1.泌尿外科;2.基本外科，北京100730)

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，CCRCC)是腎臟惡性腫瘤最常見的病理類型，發(fā)病率在不斷升高[1]，約占腎臟惡性腫瘤75%[2]。目前尚未發(fā)現(xiàn)能有效反應CCRCC 遠處轉(zhuǎn)移及預后的腫瘤指標。腫瘤的TNM分期仍為反應該疾病預后的最重要的指標。

N-WASP(neural Wiskott-Aldrich syndrome protein)蛋白對細胞肌動蛋白的聚集和細胞肌動蛋白骨架的重構(gòu)起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)N-WASP的表達與乳腺癌及結(jié)腸癌細胞局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[3-6]。但目前尚無對N-WASP 在CCRCC中的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2006年8月至2008年11月73例腎癌患者于北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科行根治性腎切除術(shù)或腎部分切除術(shù)。術(shù)后病理診斷為CCRCC。臨床病理資料詳見表1。

腫瘤組織分級參照WHO 腫瘤分級標準[7]。TNM分期參照國際抗癌聯(lián)盟TNM分期第五版標準[8]。臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會AJCC 第七版標準[8]。該實驗均經(jīng)患者知情同意，并由北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 腎透明細胞癌患者臨床病理學指標Table1 Clinicopathological features of patients with CCRCC

1.2 方法

1.2.1 組織芯片構(gòu)建:73例患者手術(shù)切除標本制成腎癌組織與癌旁正常腎組織的組織芯片。

1.2.2 免疫組織化學染色:兔抗人N-WASP 多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology 公司)及兩步染色法試劑盒(EnVisionTM+kit，Dako 公司)對組織芯片行N-WASP 免疫組化染色。將4 μm 厚度組織芯片加熱后置于二甲苯溶液中脫蠟，并依次置入梯度濃度乙醇溶液中水化。將10 mmol/L 枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)加熱至100℃，放入組織芯片加熱10～15 min進行抗原熱修復。后加入3% H2O2溶液，室溫反應10 min 以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。再將組織芯片加入一抗，稀釋濃度為1∶50，置于48℃水浴箱中孵育過夜。經(jīng)PBS 洗片后加入二抗，于37℃水浴箱中孵育30～60 min。使用二甲聯(lián)苯胺(DAB)對N-WASP顯色。陰性對照使用相同濃度非免疫兔血清作為一抗。免疫組化細胞質(zhì)染色為陽性細胞。細胞染色強度評判依據(jù)為:0級，陽性染色細胞總數(shù)＜10%;1級，陽性染色細胞總數(shù)10%～50%;2級，陽性染色細胞總數(shù)＞50%[9]。0級、1級、2級分別對應N-WASP 弱、中、強表達。

1.2.3 隨訪:完整隨訪43例患者，隨訪時間為2至74個月，中位隨訪時間53個月。

1.3 統(tǒng)計學分析

McNemar 和Mann-Whitney U 檢驗腎癌組織與癌旁正常腎組織中N-WASP表達差異?？ǚ綑z驗分析腎癌組織N-WASP表達與患者臨床病理資料的相關(guān)性。Kaplan-Meier 方法評估患者總體生存率，并使用log-rank 檢驗分析生存曲線。Cox 比例風險回歸模型進行單因素及多因素預后分析。使用SPSS 13.0 軟件包進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

癌旁正常腎組織N-WASP 染色強，并主要表達于細胞質(zhì)及細胞核;而癌組織N-WASP表達弱，主要表達于細胞核(圖1)。正常腎組織N-WASP 染色強于癌組織(P＜0.001)(表2)。CCRCC 病理分級與癌組織N-WASP表達水平具有顯著相關(guān)性(P＜0.05)。隨訪43例患者中，27 人癌組織N-WASP 呈弱、中度表達，其中4 人因腎癌死亡。16 人癌組織N-WASP 強表達，其中10 人死于腎癌。癌組織NWASP表達呈弱、中度表達的患者生存率高于呈強表達的患者(P＜0.01)。單因素預后分析顯示，癌組織N-WASP表達水平(P＜0.01)，患者手術(shù)時年齡(P＜0.05)及腎癌病理級別(P＜0.05)與患者總體預后有關(guān)(表3)。多因素預后分析顯示，腎癌組織N-WASP表達水平可以作為預測CCRCC 預后的獨立預測因素(P＜0.05)(表4)。

圖1 N-WASP 在腎透明細胞癌及癌旁正常腎組織中的表達Fig1 N-WASP expression in normal renal tissues and CCRCC(×200)

表2 癌組織及癌旁腎組織N-WASP表達水平Table2 Expression profiling of N-WASP in CCRCC and normal renal tissue

表4 腎透明細胞癌患者生存相關(guān)多因素分析Table4 COX multivariate analysis of clinicopathological parameters and overall survival

3 討論

WASP蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein)在1994年首次發(fā)現(xiàn)[2]。1996年，一種與WASP 有近50%的相似度的新蛋白被純化。由于在哺乳動物神經(jīng)組織內(nèi)表達水平最高，因此被命名為neural-WASP(N-WASP)[3，10]。WASP 與N-WASP 結(jié) 合 并激活Arp2/3 復合物，使肌動蛋白由單體形式聚合成肌動蛋白絲多聚體，參與細胞肌動蛋白骨架的重構(gòu)，改變細胞的形態(tài)及活動力[4]。惡性腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移過程包括:局部擴增，從原發(fā)灶脫落，穿透基底膜屏障，遷入并遷出血管，在轉(zhuǎn)移灶生長。整個過程均由腫瘤細胞形態(tài)改變和運動能力介導。N-WASP在調(diào)節(jié)細胞形態(tài)及運動能力中發(fā)揮重要作用[5]。盡管N-WASP 在惡性腫瘤局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移中起著重要作用，但其表達特點在不同惡性腫瘤中卻不盡相同。

對乳腺癌細胞的研究顯示，敲除N-WASP的活性片段，使得MTLn3 乳腺癌細胞失去N-WASP的活性[11]，腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移能力下降。而另有研究顯示，N-WASP 在乳腺癌組織中的表達明顯下調(diào)，特別是在惡性程度高，或淋巴結(jié)陽性等預后較差的病例中，表達下調(diào)尤為明顯[12]。將MDA-MB-231 侵襲性乳腺癌細胞系N-WASP 過表達，可使細胞活動度和侵襲能力下降。食管癌組織中N-WASP表達水平升高，然而并未發(fā)現(xiàn)N-WASP表達水平與患者的總體預后存在相關(guān)性[13]。肝細胞癌的研究也提示，肝細胞癌中N-WASP表達上調(diào)，且能提示患者預后[14]。

該研究發(fā)現(xiàn)N-WASP表達在CCRCC 中明顯下降。但是，N-WASP 在CCRCC 中的表達與腫瘤病理分級相關(guān)。這說明在不同腫瘤中N-WASP的表達存在組織特異性，提示其在腫瘤發(fā)生中起不同作用。另外，N-WASP的表達并不是固定的:N-WASP 在正常腎組織中高表達，而在早期CCRCC 中有降調(diào)節(jié)，隨著腫瘤進展再次升高。這提示N-WASP的表達存在時間特異性。

有趣的是，另一腫瘤標志物在CCRCC 中也有著相似的表達模式。ZBP-89 蛋白在腎透明細胞癌中的表達也低于正常腎組織[15]。ZBP-89 在腫瘤組織中的表達與腫瘤TNM分期和遠處轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性:腫瘤組織中ZBP-89 高表達提示患者預后不良。單因素和多因素分析也發(fā)現(xiàn)ZBP-89是總體生存率的潛在預后因素。

N-WASP 在CCRCC 中的表達下降。腫瘤組織中該蛋白表達水平與病理分級相關(guān)。腫瘤中N-WASP高水平表達提示CCRCC患者預后不良。N-WASP表達水平可以作為預測CCRCC 預后的獨立預測因素。N-WASP 對CCRCC 發(fā)展方面的作用機制，還需要更進一步的研究闡明。

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