吳靜怡，黃 亮，周劍峰，裴仁治，張丕勝，劉旭輝，杜小紅

(1.寧波市鄞州人民醫(yī)院 血液內科，浙江 寧波315000;2.華中科技大學 同濟醫(yī)學院 同濟醫(yī)院 血液內科，湖北 武漢430030)

越來越多證據顯示外周血中的血管內皮細胞并不全部是成熟血管內皮細胞，特別是腫瘤患者的循環(huán)內皮細胞(circulating endothelial cells，CECs)往往表現出與成熟內皮細胞不同的特征[1]。慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)患者CECs 數量是健康對照9倍，同時表現出更強的增殖能力[2]，進一步揭示了腫瘤與其CECs 間的密切關系，而腫瘤患者的CECs 水平也逐漸成為反映腫瘤惡性程度的重要指標[3]。本研究分離CML患者的CECs，將其與成熟內皮細胞進行一系列生物學性狀對比分析，同時檢測CECs 上腫瘤特異bcr/abl 融合基因的表達水平探討其在腫瘤侵襲發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

2009年10月至2014年2月鄞州人民醫(yī)院初診的12例CML患者，男性7例，女性5例，年齡21～65歲，患者初發(fā)時白細胞在(14～243)×109/L。CML 診斷及分期標準詳見張之南等主編的《血液病診斷及療效標準》。染色體標本取自患者骨髓，應用24 h 短期培養(yǎng)法，行常規(guī)染色體G 顯帶技術核型分析，分析細胞數20個。核型異常描述參照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISSN 2009)》的有關規(guī)定(表1)。以上研究方案獲得我院倫理委員會批準，受試者在受試前知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑

內皮細胞完全培養(yǎng)基(EGM)和胰蛋白酶(Becton Dickinson);VWF 單抗、FITC 標記的二抗(DAKO)，FITC-CD133、FITC-CD45、FITC-CD146、PECD34 單抗(BD);FITC-KDR 單抗(Sigma 公司);bcr/abl 探針(北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血管內皮細胞分離:初治患者無菌操作下取外周血(肝素抗凝)約20 mL，分離單個核細胞，按免疫磁珠分選說明書進行雙次分選，收集CD45－、CD146+的細胞懸于EGM，接種到2%明膠包被的培養(yǎng)瓶中進行體外培養(yǎng)。無菌條件下取正常剖腹產新生兒臍帶20～30 cm，參見文獻[4]進行人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的分離培養(yǎng)。

1.3.2 細胞增殖曲線測定:取狀態(tài)良好的CECs 及HUVECs 消化后等量接種到24孔板中，分成7 組，每組3 孔，培養(yǎng)7 d。從接種次日起每24 h 分別取3個孔計數，取平均值，以時間為橫軸，細胞數為縱軸，繪制增殖曲線。

1.3.3 表面抗原測定:貼壁細胞制成細胞懸液，分別加入FITC-CD133、FITC-CD45、FITC-CD146、FITCKDR、PE-CD34 及同型對照，避光反應30 min，上流式細胞儀收集20 000個細胞，復測3次，熒光強度以對數放大，結果以百分率表示。貼壁細胞增殖至80%匯合時用1∶1 甲醛/丙酮固定，按說明書進行VWF 熒光染色。

1.3.4 FISH檢測:嚴格按探針說明書對CECs 進行FISH檢測，用FISH 軟件KARYO3.0 采集圖像，具體參見文獻[5]。

1.4 統(tǒng)計學分析

SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數據以采用均數±標準差(±s)表示，Mann-Whitney 檢驗兩組表達的差異性。

2 結果

2.1 血管內皮細胞形態(tài)學特征

原代培養(yǎng)細胞接種后約4 h 開始貼壁生長，剛貼壁的細胞呈圓形，培養(yǎng)24 h后呈現鋪路石狀鑲嵌排列，細胞為扁平多角形或梭形，邊界清楚，胞質豐富(圖1A)。HUVECs 在培養(yǎng)第7天逐漸匯合成單層長梭形或多邊形貼壁細胞，(圖1B)，而CML 急變期患者CECs 在培養(yǎng)第7天可見簇狀聚集的早期克隆出現，中間是圓形細胞，周邊有向外爬行生長的長梭形或多邊形細胞，細胞間相互連接(圖1C)。

2.2 體外增殖潛能對比

細胞接種后第1天數量略有減少;第2 天開始增殖，但速度較慢;從第3 天開始增殖速度加快，進入對數增殖期;CML-BP 患者CECs增殖曲線陡直上升(圖2)，細胞倍增時間約為2～3 d，而HUVECs增殖曲線緩慢平坦上升，細胞倍增時間約為6～7 d。

2.3 CML患者臨床特征及FISH 結果

12例CML患者臨床特征詳見表1，全部表現為Ph 染色體陽性。CML患者CECs 中bcr/abl 陽性率為10.77%，并隨著疾病進程逐漸上升，呈正相關的趨勢(表2)。

圖1 CECs 及HUVECs的形態(tài)學特征Fig1 Morphology and phenotype of CECs and HUVECs

圖2 CML-BP 患者CECs 和HUVECs 體外培養(yǎng)的增殖曲線Fig2 Proliferation curves of CECs in CML-BP patients and HUVECs

表1 CML患者的主要臨床特征Table1 Principal clinical characteristics of CML patients

2.4 表型特征對比

兩組細胞均不表達白細胞共同抗原CD45，而高表達泛內皮細胞標記CD146。95%以上的CML患者CECs 及HUVECs 組均表達VWF，鑒定為血管內皮細胞。與HUVECs 相比，CML患者的CECs 高表達CD34 及KDR(P＜0.05)(圖3)。

CD133是目前區(qū)分成熟內皮細胞與內皮祖細胞的唯一標記[6]。CML患者CECs 中CD133 陽性率(31.29%)明顯高于HUVECs(4.65%，n =5)(P＜0.05)。在疾病的3個階段慢性期、加速期及急變期，CD133的陽性率呈逐漸上升趨勢，與疾病進程呈正相關的趨勢(表2)。

表2 CML患者CEC 中CD133 及bcr/abl表達水平對比Table2 Expression level of CD133 and bcr/abl fusion gene between HUVECs and CECs in CML patients(%，n=12)

3 討論

實驗顯示CML患者的CECs與分化成熟的HUVECs 相比，有著更強的增殖潛能。這些CECs表達更高水平的內皮祖細胞標記CD34、CD133，而KDR的高表達預示著細胞對血管內皮生長因子更敏感，增殖力和血管生成能力更強[7]。

外周血中CECs的數量較少[8]，但近年的研究發(fā)現多種腫瘤中CECs 數量明顯增多，CECs 甚至成為某些腫瘤診斷和評價預后的指標[9]。這些CECs與成熟內皮細胞相比，祖細胞的標記表達增多，從而有著更強的增殖能力，與本實驗結果相一致。

由于腫瘤的CECs 在生物學性狀上明顯不同于成熟內皮細胞，它們的來源以及與腫瘤細胞的關系逐漸受到學者們的關注[10]。CML患者的CECs 中檢測到了bcr/abl 融合基因，而且隨著疾病進展，表達bcr/abl 融合基因的CECs 數量也逐漸增多，這種腫瘤特異性基因來源于骨髓中的白血病細胞，參與造血干細胞自我更新及促進惡性細胞增殖。推測骨髓中帶有腫瘤特異基因的內皮祖細胞進入外周血從而到達全身各組織器官，形成腫瘤血管系統(tǒng)進而為腫瘤細胞的增殖提供條件和幫助，隨著腫瘤生長，這些CECs的數量也不斷增加，而bcr/abl 陽性的內皮細胞在CML患者心臟的微血管組織中被發(fā)現[11]，就證實了這種骨髓來源內皮細胞的存在。

實驗結果顯示，CML患者的CECs 水平與腫瘤細胞增殖是密切相關的，對于評價臨床治療效果及預后的有一定的指導意義。

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