湯曉穎，龐林賓，宋立文，王洪林*

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，重慶400016;2.德州市人民醫(yī)院普外科，山東 德州253000;3.重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院 肝膽外科，重慶401331)

肝癌是常見惡性腫瘤之一，臨床發(fā)現(xiàn)多處于晚期，治療效果不理想，影響其治療效果的因素較多，其中腫瘤的血管生成擬態(tài)起到重要作用。腫瘤的血管生成擬態(tài)可影響腫瘤的轉移，是近年研究的熱點。XAV939是一種小分子選擇性抑制劑，較特異的抑制Wnt/β-catenin信號通路[1]。本研究應用XAV939 作用于人肝癌HepG2細胞，探討Wnt/β-catenin信號通路在人肝癌HepG2細胞血管生成擬態(tài)形成中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細胞系(中科院上海細胞所)，XAV939(Sigma 公司)，CCK8 試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)，RT-PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)，β-catenin、ZEB1 及MMP-7 單抗(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組:HepG2細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640，置于37℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25% 胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化傳代，取對數(shù)期細胞進行實驗。實驗分為對照組和實驗組(0.5 和1 μmol/L XAV939 分別處理HepG2細胞48 h)。

1.2.2 CCK8 檢測XAV939對HepG2細胞生長的影響及實驗組藥物濃度選擇:將HepG2細胞用培養(yǎng)液配成單細胞懸液，以1×104/孔(90 μL)接種于3塊96孔板，每塊分為實驗組、細胞對照組和試劑對照組，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，實驗組分別加入10 μL 終濃度分別為0.5、1、5、10 和50 μmol/L的XAV939，其余組加等體積RPMI1640 培養(yǎng)液，每組3個復孔。每塊96孔板分別培養(yǎng)24、48 和72 h后，每孔更換新培養(yǎng)基100 μL，再加入CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標儀450 nm 波長下檢測各孔A值，實驗重復3次。

1.2.3 體外成管實驗[2]:將Matrigel 基質膠用RPMI1640 1∶3 稀釋后以200 μL/孔鋪到24孔板底，紫外燈下過夜，然后置于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min備用。取用各組細胞以5×104/孔接種到24孔板內(nèi)，每組設3個復孔，48 h 換液，3 d后照相，任取5個不重疊視野計算成管數(shù)。實驗重復3次。

1.2.4 RT-PCR檢測細胞ZEB1 及MMP-7 mRNA水平的表達:按照Trizol RNA 抽提試劑盒和RT-PCR試劑盒說明書進行操作。ZEB1 序列上游:5'-GG TTTGGTGTCTCCCATAAGT-3'，下 游:5'-GCTGCTTT AGGTCATAGTGCTT-3'，產(chǎn)物長度466 bp，退火溫度52.6℃;MMP-7 序列上游:5'-GGAACAGGCTCAGG ACTATCT-3'，下 游:5'-GTCAGCAGTTCCCCATACA A-3'，產(chǎn)物長度364 bp，退火溫度50.0℃;GAPDH序列上游:5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGA-3'，下游:5'-CCATCACGCCACAGTTTCC-3'，產(chǎn)物長度585 bp，退火溫度56.2℃。Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One 軟件分析吸光度值，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot檢測細胞β-catenin、ZEB1 和MMP-7 蛋白表達:提取各組細胞總蛋白，經(jīng)SDSPAGE 電泳分離后轉膜，5% 脫脂奶粉37℃封閉1.5 h后，分別加入一抗β-catenin、ZEB1、MMP-7(抗體稀釋度分別是1∶500、1∶500 及1∶800)及β-actin(1∶1 000 稀釋)，4℃孵育過夜;TBST 洗膜，加入HRP 標記的山羊抗兔二抗(1∶2 500 稀釋)，37℃孵育1.5 h;TBST 洗膜，ECL法進行顯影。Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One 軟件分析吸光度值，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差(±s)表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用LSD 法。

2 結果

2.1 XAV939對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用

XAV939對HepG2細胞具有呈量效-時效關系的增殖抑制作用(圖1)。

2.2 XAV939對人肝癌HepG2細胞形成血管生成擬態(tài)的影響

各組細胞成管數(shù)目，對照組:9.67±0.70;0.5 μmol/L 組:5.67±0.64;1 μmol/L 組:2.27±0.81。實驗組與對照組相比，管狀結構數(shù)目明顯減少(P＜0.01)(圖2)。

2.3 XAV939對人肝癌HepG2細胞ZEB1 和MMP-7 mRNA表達的影響

ZEB1表達量(ZEB1/GAPDH)對照組:0.83±0.05，0.5 μmol/L 組:0.33±0.02，1 μmol/L 組:0.23±0.02;MMP-7表達量(MMP-7/GAPDH)對照組:0.73±0.01，0.5 μmol/L 組:0.50±0.03，1 μmol/L組:0.36±0.02。實驗組與對照組相比，ZEB1及MMP-7 mRNA表達量減少(P＜0.05)(圖3)。

圖1 XAV939對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用Fig1 Effect of XAV939 on human hepatoma HepG2 cells proliferation

圖2 XAV939對人肝癌HepG2細胞形成血管生成擬態(tài)能力的影響Fig2 Effect of XAV939 on forming vascular mimicry ability of human hepatoma HepG2 cells(×200)

圖3 XAV939對人肝癌HepG2細胞ZEB1 及MMP-7 mRNA表達的影響Fig3 Effect of XAV939 on expression of ZEB1 and MMP-7 mRNA in human hepatoma HepG2 cells

2.4 XAV939對人肝癌HepG2細胞β-catenin、ZEB1 和MMP-7 蛋白表達的影響

各組蛋白表達情況(圖4A)。與對照組相比，β-catenin、ZEB1 和MMP-7 蛋白的相對表達量降低(P＜0.05)(圖4B)。

圖4 XAV939對人肝癌HepG2細胞β-catenin、ZEB1 和MMP-7 蛋白表達的影響Fig4 Effect of XAV939 on expression ofβ-catenin、ZEB1 and MMP-7 proteins in human hepatoma HepG2 cells

3 討論

血管生成擬態(tài)(vascular mimicry，VM)是某些高度惡性腫瘤內(nèi)一種新的腫瘤血液供應方式，在沒有內(nèi)皮細胞參與下，惡性腫瘤細胞通過自身變形，成為腫瘤生長、侵襲和轉移提供血供的特有的微循環(huán)管道。目前已證實多種轉錄因子如鋅指E 盒結合同源異型盒1(Zinc finger E-box binding homeobox1，ZEB1)[3]、Twist1[4]及MMP-7[5]等參與了VM的形成。

腫瘤血管生成擬態(tài)的形成，需經(jīng)過腫瘤細胞向上皮細胞的轉化過程，即上皮-間質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)過程[3-4]，而EMT 與多種通路相關[6-7]，其中參與EMT 形成之一的Wnt/β-catenin信號通路能否影響VM的形成目前相關報道較少。

Wnt/β-catenin信號在肝癌等[8]多種腫瘤細胞中存在異常激活，導致Axin、APC、GSK3 等無法形成降解復合物對β-catenin 進行泛素化和蛋白酶體介導的降解，從而聚集在胞質中并隨后進入細胞核與TCF/LEF 結合，由此調(diào)控眾多下游靶基因(如MMP-7、ZEB1、c-myc 等)的轉錄和蛋白合成。而XAV939 通過抑制多聚ADP 核糖基酶端錨聚合酶1和2 來穩(wěn)定AXIN的表達，促進形成降解復合物，使β-catenin 降解[1]。目前已證實XAV939 能有效阻斷Wnt/β-catenin通路，抑制平滑肌瘤細胞和神經(jīng)母細胞瘤的增值和生長[9-10]。本研究為了避免XAV939對細胞生長抑制作用導致細胞數(shù)目的減少對后續(xù)實驗的影響，故選擇0.5 及1 μmol/L XAV939濃度處理人肝癌HepG2細胞，結果細胞形成管狀結構數(shù)目顯著減少，表明XAV939 能有效抑制人肝癌HepG2細胞血管生成擬態(tài)的形成。

Wnt/β-catenin通路的激活總是伴隨著β-catenin蛋白的激活，本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白降低，說明XAV939抑制人肝癌HepG2細胞血管生成擬態(tài)的同時，也伴隨Wnt/β-catenin信號通路被阻斷現(xiàn)象。另一方面，Wnt/β-catenin信號通路下游血管擬態(tài)相關因子ZEB1 和MMP-7的表達減少，說明XAV939對血管生成擬態(tài)的抑制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路起作用。綜合上述，XAV939 可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，降低其下游血管擬態(tài)相關因子ZEB1 和MMP-7的表達，從而抑制人肝癌HepG2細胞血管生成擬態(tài)的形成。表明Wnt/β-catenin信號通路在肝癌細胞血管生成擬態(tài)的形成中起促進作用。參與EMT 形成的其他通路能否影響VM，有待進一步研究。

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