安 靜，朱筑霞，王紅梅，李 錚，何 艷，陳華妹，王旭東

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，貴州 貴陽550004;2.武警貴州省總隊醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽550005)

表皮生長因子受體(epithelial growth factor，EGFR)過度表達(dá)是雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性乳腺癌的生物學(xué)特征之一[1]，該受體屬于酪氨酸激酶受體(RTKs)家族ErbB/ HER 成員之一[2]。研究指出，EGF 可以激活鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP)信號傳導(dǎo)活動[3]。CANP是一種高度保守并依賴鈣激活的細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶，參與調(diào)節(jié)許多腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、信號傳導(dǎo)及穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等在內(nèi)的多種生物學(xué)活動[4-5]。乳腺癌細(xì)胞和組織中CANP 蛋白表達(dá)水平及酶活性明顯高于正常對照[6]。局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是CANP的敏感性底物之一，CANP 對FAK的蛋白剪切可能是CANP 促進(jìn)細(xì)胞增殖的一種重要機(jī)制[7]，F(xiàn)AK是一種胞內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶，為細(xì)胞內(nèi)重要的骨架蛋白及多種信號通路的關(guān)鍵分子，其活性與腫瘤細(xì)胞增殖和遷移密切相關(guān)[5]。EGF 可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞集落形成，但其信號機(jī)制尚未完全明了。本研究以ER陰性人乳腺腫瘤系MDA-MB-231 為研究模型，探討CANP 在EGF 促進(jìn)ER陰性乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)。DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶及青霉素/鏈霉素(Hyclone 公司);活性碳處理胎牛血清(charcoal-stripped fetal bovine serum，CS-FBS)(Biowest 公司);二甲亞楓(DMSO)及表皮生長因子受體抑制劑(EGFR-I)(Sigma 公司);人表皮生長因子(EGF)(Peprotech 公司);CANP抑制劑Calpeptin(CALP)(Calbiochem 公司)，抗CANPI 大亞基抗體(Santa Cruz 公司);抗FAK 單克隆抗體(Millipore 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理:細(xì)胞培養(yǎng)MDA-MB-231 細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)采用DMEM 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)，在37℃、潮濕環(huán)境及5% CO2條件下培養(yǎng)。實驗分組CANP抑制劑CALP 和表皮生長因子受體抑制劑(EGFR-I)作用的觀察:實驗細(xì)胞分為EGF(10 ng/mL)+DMSO組(對照)、EGF(10 ng/mL)+CALP(50 μmol/L)組和EGF(10 ng/mL)+EGFR-I(50 μmol/L)組，處理在0～24 h 內(nèi)裂解細(xì)胞提取蛋白。細(xì)胞處理:細(xì)胞在有酚紅完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)至50%匯合后，換含無酚紅(phenol red，PR)DMEM 加5% CS-FBS 培養(yǎng)24 h，然后在無血清、無酚紅(PR-free)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按實驗設(shè)計要求加入EGF(10 ng/mL)處理細(xì)胞0～24 h。

1.2.2 蛋白印記法檢測FAK 和CANP1蛋白表達(dá):細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%匯合，加入RIPA細(xì)胞裂解液，取樣品上清液留用，采用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將分離的蛋白點(diǎn)轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Milipore 公司);抗體處理后，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒(Milipore 公司)進(jìn)行顯色，采用自動凝膠成像系統(tǒng)(Syngene 公司)成像及GeneSnap軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞集落形成實驗檢測集落形成率對數(shù)增殖期MDA-MB-231 細(xì)胞:采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按照每皿含100個細(xì)胞的濃度接種2 mL細(xì)胞懸液到6孔板(直徑60 mm)中，常規(guī)培養(yǎng)2～3 周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見集落時，終止培養(yǎng)，甲醇固定15 min，干燥后用Giemsa 染液染色10 min，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。倒置顯微鏡下計數(shù)超過50個細(xì)胞的集落數(shù)。集落形成率=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計處理和分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EGF誘導(dǎo)模型細(xì)胞FAK蛋白上調(diào)及剪切

EGF(10 ng/mL)作用12～24 h 可引起FAK蛋白上調(diào)并出現(xiàn)剪切效應(yīng)，EGF 刺激對周期蛋白E 也有類似作用(圖1A)。量-效觀察顯示，EGF濃度為10 ng/mL時誘導(dǎo)FAK 和周期蛋白E 反應(yīng)的效應(yīng)最為明顯(P＜0.01)(圖1B)。

2.2 CANP抑制劑阻斷EGF誘導(dǎo)的FAK蛋白表上調(diào)及剪切的效應(yīng)

用CALP 預(yù)處理模型細(xì)胞，可顯著抑制EGF誘導(dǎo)的FAK 上調(diào)及剪切反應(yīng)(圖2A)。EI(50 μmol/L)可阻斷EGF的上述效應(yīng)(圖2B)。

圖1 EGF誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞FAK表達(dá)上調(diào)及蛋白剪切Fig1 EGF stimulates up-regulation and processing of FAK and cyclin E in MDA-MB-231 cells

圖2 CALP 和EI 對EGF誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞FAK蛋白剪切反應(yīng)的影響Fig2 Pretreatment of cells with CALP or EGFR-I tremendously suppresses EGF-stimulated cleavage of FAK protein in MDA-MB-231

2.3 EGF誘導(dǎo)FAK蛋白剪切伴隨CANP1 自身蛋白水解

EGF 處理MDA-MB-231 細(xì)胞引起FAK蛋白剪切的同時，還伴隨CANP1的自身蛋白水解，而CALP 預(yù)處理細(xì)胞可阻斷EGF誘導(dǎo)的CANP1 自身蛋白水解(圖3)。

圖3 EGF誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞CANP1自身蛋白水解Fig3 EGF stimulating actions on FAK and coincident autolysis of calpain1 in MDA-MB-231

2.4 CALP抑制EGF誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖

以EGF 處理模型細(xì)胞，可顯著促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞集落的形成(P＜0.05)，而CALP 可顯著抑制EGF的促集落形成效應(yīng)(P＜0.05，P＜0.01)(圖4)。

圖4 EGF誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞集落形成及CALP的抑制作用Fig4 EGF-enhanced colony formation is greatly suppressed by calpeptin in MDA-MB-231

3 討論

ER陰性乳腺癌對抗雌激素治療不敏感，臨床預(yù)后差。已發(fā)現(xiàn)在ER(－)的乳腺癌細(xì)胞中常伴有表皮生長因子受體Her2/neu的表達(dá)升高[8-9]，推測EGF(Her1)信號通路可能在ER(－)乳腺癌細(xì)胞增殖調(diào)控過程中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)EGF 可以刺激ER陰性的MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞集落形成，而雌激素對該細(xì)胞集落形成無明顯影響;雌激素可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞周期蛋白E 蛋白剪切和細(xì)胞增殖，而此效應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)CANP 活性有關(guān)[10]，提示CANP 可能參與促進(jìn)乳腺癌的惡性演進(jìn)過程。

CANP 屬于Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞中普遍表達(dá)CANP1 和CANP2。CANP1/CANP2由一個共同的28Ku 小(調(diào)節(jié))亞基和不同的80Ku大(催化)亞基組成，通常以酶原的形式存在，其激活一般需要胞內(nèi)鈣動員的觸發(fā)[4]，但CANP 也可在細(xì)胞外EGF的作用下通過MAPK 通路激活，并參與介導(dǎo)EGF誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)[3]，CANP 參與促進(jìn)腫瘤侵襲的機(jī)制可能與CANP 對相關(guān)特異性底物的蛋白剪切作用有關(guān)[5-7]。本研究采用CALP抑制CANP 活性，發(fā)現(xiàn)EGF誘導(dǎo)細(xì)胞集落形成的作用受到顯著抑制。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，EGF 可誘導(dǎo)CANP1催化亞基自身蛋白水解，此效應(yīng)也受到了CALP的明顯抑制。這些結(jié)果提示，細(xì)胞內(nèi)CANP 可能參與介導(dǎo)EGF 刺激ER(－)乳腺癌細(xì)胞增殖。

有研究指出，CANP 通過對FAK的蛋白剪切影響FAK 激酶活性[11]。FAK 具有酪氨酸蛋白激酶活性，并可發(fā)生自身磷酸化，F(xiàn)AK 介導(dǎo)的信號活動影響細(xì)胞的凋亡、增殖及遷移等生物學(xué)行為，其機(jī)制可能與FAK 增加細(xì)胞DNA 合成和加快G1/S期轉(zhuǎn)換有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，EGF 可誘導(dǎo)細(xì)胞FAK蛋白剪切伴隨細(xì)胞增殖活動增強(qiáng)，此效應(yīng)受到CALP的顯著抑制，提示FAK 在CANP 通路介導(dǎo)的EGF誘導(dǎo)效應(yīng)中發(fā)揮作用。臨床上ER陰性乳腺癌往往預(yù)后較差，而本研究提示CANP 可能是ER陰性乳腺癌分子靶向治療的一個潛在靶點(diǎn)。

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