沈 茜，高 進，陳 萍

(重慶醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 麻醉科，重慶400016)

N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA)受體是一種離子型谷氨酸受體，越來越多的證據(jù)表明NMDA受體參與疼痛信號傳遞。在多種疼痛模型中，外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NMDA受體表達明顯增高，給予NMDA受體拮抗劑能明顯緩解疼痛[1]。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是具有神經(jīng)營養(yǎng)性的多效性細胞因子，廣泛分布在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。近來研究表明，bFGF對神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展也起著重要作用[2]。在坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(spared nerve injury，SNI)大鼠脊髓背角，bFGF表達明顯升高[3]。bFGF 能通過激活脊髓星形膠質(zhì)細胞來參與疼痛，而活化的星形膠質(zhì)細胞又不斷分泌bFGF。有研究發(fā)現(xiàn)bFGF 能通過影響細胞谷氨酸受體表達來調(diào)節(jié)細胞對谷氨酸的反應[4]。但bFGF對坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠脊髓內(nèi)NMDA受體表達的影響尚無相關報道。本研究擬通過建立大鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷疼痛模型來觀察bFGF對脊髓NMDA受體亞基表達的影響，旨在探討神經(jīng)病理性疼痛可能的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量200～250 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供[動物許可證SYXK(渝)2007-0001]。適應性飼養(yǎng)1周。采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為4組(n=12):假手術組(A組);假手術+bFGF 抗體組(B組);SNI組(C組);SNI+bFGF 抗體(D組)。

1.1.2 主要試劑:兔抗大鼠bFGF、NR2A 一抗和羊抗大鼠NR1、NR2B 一抗(Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠GFAP 一抗(Abcom 公司);羊抗兔IgG、兔抗羊IgG 和羊抗小鼠IgG(武漢博士得生物工程有限公司);DAB 顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司);Trizol 和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司);RIPA 裂解液及BCA蛋白分析試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及鞘內(nèi)給藥:采用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(spared nerve injury，SNI)方法制備神經(jīng)病理性痛模型[5]。C組和D組暴露坐骨神經(jīng)及其分支，游離并結扎腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，在結扎的遠端切斷部分神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)并避免過分牽拉;A組和B組僅暴露坐骨神經(jīng)及其分支。采用鞘內(nèi)直接注射給藥法，麻醉后取L5-6椎間隙，50 μL 微量進樣器直接穿刺進入蛛網(wǎng)膜下腔，以突然出現(xiàn)側(cè)向甩尾運動作為為穿刺成功[6]。B組和D組分別于建模后1、6、9、13、16、20 天鞘內(nèi)注射bFGF 抗體18 μg，藥物總?cè)萘繛?0 μL[7-8]。A、C組則在相同時間點注射相同體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)。

1.2.2 機械痛閾測定:參照文獻[9]的方法，于術前1天及術后1、4、7、14、21天測定大鼠左后肢機械縮足反射閾值(PWMT)。各組大鼠于第21天測定完機械痛閾值后處死。

1.2.3 免疫組化檢測脊髓膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達:4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定后采集脊髓L4-6組織，石蠟包埋切片。切片脫蠟、水化、抗原修復、封閉，加小鼠抗大鼠GFAP 一抗(1∶100)4℃過夜，加生物素標記羊抗小鼠IgG 室溫20 min，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。置于光學顯微鏡下觀察拍照，計算GFAP 免疫反應陽性細胞數(shù)。

1.2.4 RT-PCR檢測脊髓NR1、NR2A 和NR2B mRNA表達:采集大鼠脊髓L4-6組織保存于液氮中，一部分用于RT-PCR檢測，一部分用于Westem blot檢測。Trizol 法提取脊髓組織RNA，檢測RNA濃度和純度，取A260/A280值在1.8～2.0的RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR 反應采用20 μL 體系，引物序列見表1，擴增條件:95℃5 min;95℃45 s，59℃45 s，72℃1 min，共36個循環(huán);72℃5 min。PCR反應產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳成像，Quantity One 軟件分析條帶吸光度值，目的基因相對表達量以目的基因與內(nèi)參基因吸光度比值來表達。

表1 RT-PCR引物序列Table1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.5 Westem bolt 檢測脊髓NR1、NR2A 和NR2B蛋白表達:PIPA 裂解液提取脊髓組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉，加一抗(1∶1 000)4℃過夜，次日加二抗(1∶1 000)室溫1 h，洗膜后ECL 顯色，暗室曝光成像，Quantity One 軟件分析條帶吸光度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白吸光度比值來表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組內(nèi)比較采用重復測量方差分析。

2 結果

2.1 大鼠術后一般情況

大鼠術后一般健康狀況良好。A、B組大鼠術后未出現(xiàn)運動障礙和姿勢異常，C、D組大鼠則表現(xiàn)出跛行且動作不協(xié)調(diào)，左后趾并攏，跖屈，輕微外翻畸形，有舔左足、無刺激條件下自發(fā)性縮足反射、懸空左后肢等保護姿勢;與C組大鼠術后相比，D組大鼠術后運動障礙和姿勢異常減輕。

2.2 大鼠機械痛閾值改變

與術前比較，C、D組術后第1天開始出現(xiàn)PWMT 下降(P＜0.05)，C組在術后第7天達到峰值，并持續(xù)至術后21天;與A、B組比較，C、D組PWMT 降低(P＜0.05);與C組比較，D組從術后第7天開始PWMT 出現(xiàn)升高(P＜0.05，表2)。

表2 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠機械性痛閾的影響Table2 Effect of bFGF antibody intrathecal injected on rat paw withdrawal mechanical threshold(g，±s，n=12)

表2 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠機械性痛閾的影響Table2 Effect of bFGF antibody intrathecal injected on rat paw withdrawal mechanical threshold(g，±s，n=12)

＊P＜0.05 compared with group A and B，#P＜0.05 compared with group C;△P＜0.05 compared with pre-operation.

group pre-operation post-operation 1 day 4 days 7 days 14 days 21 days A 14.17±1.95 14.08±1.34 13.33±2.46 13.00±3.01 13.83±2.72 14.25±1.28 B 13.42±1.20 13.16±2.75 13.75±2.26 13.58±2.61 13.17±2.75 14.58±1.44 C 13.67±1.23 4.50±1.24＊△ 3.33±1.30＊△ 1.23±0.46＊△ 2.13±0.92＊△ 2.62±1.04＊△D 14.00±2.37 4.83±1.03＊△ 3.83±1.34＊△ 3.50±1.51* #△ 4.67±1.30* #△ 6.50±1.24* #△

2.3 大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細胞形態(tài)及數(shù)量改變

A、B組術側(cè)脊髓背角中GFAP 免疫染色陽性細胞零星表達，染色較淡，胞體小，樹突細，與A、B組術側(cè)比較，C、D組GFAP 免疫染色陽性細胞數(shù)顯著增加，染色增強，胞體增大，突起變粗(P＜0.05)，與C組相比，D組GFAP表達減少(P＜0.05，圖1)。

2.4 大鼠脊髓NR1、NR2A 和NR2B mRNA表達

與A、B組比較，C組脊髓NR1、NR2B 基因表達增加(P＜0.05)。與C組比較，D組脊髓NR1、NR2B 基因表達降低(P＜0.05)(圖2，表3)。

圖1 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠脊髓GFAP 蛋白表達的影響Fig1 Effect of bFGF antibody intrathecal injection on the expression of GFAP protein in the spinal cord of rat(×400)

圖2 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠機脊髓NR1、NR2A 和NR2B mRNA表達的影響Fig2 Effect of bFGF antibody intrathecal injection on the expression of NR1，NR2A and NR2B mRNA in the spinal cord of rat

表3 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠機脊髓NR1、NR2A和NR2B mRNA表達的影響Table3 Effect of bFGF antibody intrathecal injection on the expression of NR1，NR2A and NR2B mRNA in the spinal cord of rat(±s，n=6)

表3 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠機脊髓NR1、NR2A和NR2B mRNA表達的影響Table3 Effect of bFGF antibody intrathecal injection on the expression of NR1，NR2A and NR2B mRNA in the spinal cord of rat(±s，n=6)

*P＜0.05 compared with group A and B;#P＜0.05 compared with group C.

group NR1 NR2A NR2B A 0.14±0.02 0.11±0.02 0.12±0.02 B 0.13±0.01 0.12±0.01 0.11±0.03 C 0.56±0.03* 0.10±0.01 0.43±0.02*D 0.22±0.01* # 0.11±0.01 0.15±0.01*#

2.5 大鼠脊髓NR1、NR2A 和NR2B蛋白表達

與A、B組比較，C、D組脊髓NR1、NR2B蛋白表達增加(P＜0.05)，與C組術側(cè)比較，D組脊髓NR1、NR2B蛋白表達降低(P＜0.05)(圖3，表4)。

圖3 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠脊髓NR1、NR2A和NR2B蛋白表達的影響Fig3 Effect of bFGF antibody intrathecal injection on the expression of NR1，NR2A and NR2B protein in the spinal cord of rat

表4 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠脊髓NR1、NR2A和NR2B蛋白表達的影響Table4 Effect of bFGF antibody intrathecal injection on the expression of NR1，NR2A and NR2B protein in the spinal cord of rat(±s，n=6)

表4 鞘內(nèi)注射bFGF 抗體對大鼠脊髓NR1、NR2A和NR2B蛋白表達的影響Table4 Effect of bFGF antibody intrathecal injection on the expression of NR1，NR2A and NR2B protein in the spinal cord of rat(±s，n=6)

*P＜0.05 compared with group A and B;#P＜0.05 compared with group C.

group NR1 NR2A NR2B A 0.14±0.01 0.22±0.02 0.10±0.01 B 0.15±0.02 0.21±0.02 0.09±0.01 C 0.76±0.04* 0.20±0.03 0.36±0.02*D 0.45±0.04* # 0.23±0.02 0.17±0.01*#

3 討論

迄今有多種動物模型能從不同角度模擬外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛，其中SNI 模型近年來被廣泛使用，該模型可重復性好，動物術后能出現(xiàn)明顯的機械痛覺過敏[5]。本研究參照Woolf的方法建立SNI 模型，以此探討神經(jīng)病理性疼痛可能的產(chǎn)生機制。本研究結果表明，SNI 大鼠術后PWMT 出現(xiàn)明顯降低，提示建模成功。

本實驗參照前期研究結果選擇bFGF的給藥劑量和時間，結果表明，bFGF 能減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛，同時降低星形膠質(zhì)細胞活化。bFGF是成纖維細胞生長因子家族中的原型成員，參加星形膠質(zhì)細胞相關的疼痛過敏[2，10]。bFGF 由星形膠質(zhì)細胞分泌，同時又反過來刺激其活化。Madiai 等[11]研究表明，SNL 模型大鼠脊髓bFGF 增加是伴隨著星形膠質(zhì)細胞活化的，拮抗bFGF 能降低星形膠質(zhì)細胞及bFGF表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷后，損傷側(cè)脊髓背角bFGF表達會在4 天后升高，14 天達高峰，并持續(xù)至28天，給予bFGF 中和抗體能降低TNF-α 和IL-6表達[3，8]。

NMDA受體參與痛覺信號傳遞，其表達升高在慢性神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要作用。本次研究結果表明，大鼠SNI 術后21天，NR1、NR2B 亞基表達明顯升高，而NR2A 亞基表達無差異，基因和蛋白表達結果相一致。該結果進一步證實了NR1 和NR2B 亞基在慢性神經(jīng)病理性疼痛中起主要作用。鞘內(nèi)給予bFGF 中和性抗體能明顯逆轉(zhuǎn)SNI 引起的NR1 和NR2B 亞基表達升高，提示bFGF 能夠通過改變NR1 和NR2B 亞基表達來參與疼痛調(diào)控。以往研究一般認為只有神經(jīng)元的信號傳導參與神經(jīng)病理性疼痛，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中也起著關鍵作用，但星形膠質(zhì)細胞不產(chǎn)生動作電位，其最終還需通過調(diào)控神經(jīng)元來參與疼痛形成。Ji 等[12]研究結果表明，脊髓星形膠質(zhì)細胞激活后增加IL-1β的表達從而誘導神經(jīng)元NMDA受體磷酸化來提升疼痛信號的傳遞。本研究結果也進一步證實了膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元在神經(jīng)病理性疼痛中的相互調(diào)控作用。

綜上所述，bFGF 參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和發(fā)展，其機制可能與降低脊髓NMDA受體表達，進而減少疼痛信號傳遞有關。

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