幸 宇，鄧世雄，齊 進(jìn)，姜 容，陳俊霞

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)與生物信息學(xué)研究室;2.附屬口腔醫(yī)院;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 干細(xì)胞與組織工程研究室;4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

舌癌是最為常見的口腔惡性腫瘤，男性多于女性，多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌。近年來舌癌的發(fā)病率不斷增長，并呈現(xiàn)年青化趨勢(shì)，且預(yù)防效果及早期確診差，愈后差，易轉(zhuǎn)移，5年生存率僅50%左右[1-2]。

在由整合素與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)相互作用而引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)中，整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)通過其絲氨酸/蘇氨酸激酶活性介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)傳導(dǎo)而起著重要作用[3]。除了參與某些基本的細(xì)胞生理過程外，ILK 還與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。前期作者報(bào)道了抑制ILK表達(dá)對(duì)舌癌Tb 細(xì)胞在體外的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等方面可以產(chǎn)生抑制作用[4]。在此基礎(chǔ)上，作者建立裸鼠Tb 細(xì)胞移植瘤模型，進(jìn)一步觀察ILK 沉默后對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)分子Akt、GSK3β 及其磷酸化狀態(tài)，以及對(duì)移植瘤生長、病理形態(tài)、微血管形成情況等方面的影響，并探討其可能參與腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制，以期為舌癌的治療尋找新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Tb人舌鱗癌細(xì)胞(湖南湘雅醫(yī)學(xué)院)、ILK siRNA表達(dá)質(zhì)粒(重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)教研室構(gòu)建及保存[4-5])。SPF級(jí)BALB/c 裸鼠(雌雄不限)24只，4～6周齡，體質(zhì)量(20±3)g[北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2009-004]。

1.1.2 試劑:胎牛血清(Hyclone 公司)，DMEM 培養(yǎng)基及G418 (Gibco-BRL 公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen 公司)，鼠抗人ILK單克隆抗體(Santa Cruz 公司)，兔抗人CD31、p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β 抗體(Bioworld 公司)，F(xiàn)ITC包被的羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和篩選:Tb 細(xì)胞在37℃，5% CO2飽和濕度孵育箱中，用含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種至6孔板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%左右匯合度時(shí)，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為正常組，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 將ILK siRNA表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后以G418 進(jìn)行篩選，前2周G418 為0.3 mg/mL，后6 周減半培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的系，分別命名為Tb 細(xì)胞組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常Tb 細(xì)胞)，Tb vector 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的Tb 細(xì)胞)，Tb siILK 細(xì)胞組(轉(zhuǎn)染ILK siRNA質(zhì)粒的Tb 細(xì)胞)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)ILK表達(dá):常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，5%濃縮膠上樣40 μg/孔，60 V 電泳，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入10% SDS-PAGE 凝膠時(shí)改為100 V 電泳1 h，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1.5～2 h，ILK鼠單抗(1∶300 稀釋)4℃孵育12 h，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000 稀釋)37℃孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，Bio-Rad 凝膠成像儀觀察照相，Quantity One圖像分析。

1.2.3 免疫熒光法檢查瘤細(xì)胞中Akt、p-Akt、GSK3β和p-GSK3β表達(dá):6孔板內(nèi)放置蓋玻片，接種各組細(xì)胞制作細(xì)胞爬片。待細(xì)胞增殖為單層時(shí)(達(dá)80%以上匯合度)，用80%冰丙酮固定10 min，PBS(含3%BSA)37℃封閉30 min，分別以Akt、p-Akt(S473)、GSK3β 和p-GSK3β(S9)抗體(均按1∶300 稀釋)4℃孵育過夜，PBS 清洗5 min×3次，F(xiàn)ITC 包被的羊抗兔二抗(1∶100 稀釋)于37℃避光孵育1 h，PBS 清洗5 min×3次，50%甘油封片。使用激光共聚集顯微鏡(Leica TCS-SP2)觀察并拍照，SPOT 3.5 軟件分析結(jié)果。

1.2.4 裸鼠移植瘤模型:胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌，制備成0.1 mL 含有2×106細(xì)胞的懸液。將裸鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分成3 組，每組8只，分別將前述3 組細(xì)胞懸液接種至裸鼠背部皮下，觀察各組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤率、腫瘤大小及生長速度，5周后處死裸鼠，稱取腫瘤質(zhì)量，對(duì)裸鼠內(nèi)臟器官進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查，并由2名工作8年以上的病理科醫(yī)生分別復(fù)核認(rèn)定。抑瘤率=[1 － 平均瘤質(zhì)量(Tb siILK 組)/平均瘤質(zhì)量(Tb組或Tb vector 組)]×100%。

1.2.5 HE染色及免疫熒光檢查移植瘤CD31、p-Akt和p-GSK3β表達(dá):10%多聚甲醛溶液固定腫瘤組織及肺組織。常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成5 μm 厚組織切片，二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色4 min，1%鹽酸乙醇分色15 s，流水沖洗，蒸餾水清洗3次，伊紅染色5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。瘤組織于高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野對(duì)微血管數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)并取平均值。瘤組織的CD31、p-Akt 和p-GSK3β的免疫熒光檢查步驟同1.2.2 所述。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ILK蛋白表達(dá)檢測(cè)

ILK蛋白的表達(dá)水平Tb siILK 組分別為Tb組和Tb vector 組的66%和67%，表達(dá)明顯下降(P＜0.01)(圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞ILK蛋白的表達(dá)Fig1 Western blot of ILK protein in Tb cells of each group

2.2 ILK siRNA對(duì)Tb 細(xì)胞及移植瘤Akt 和GSK3β表達(dá)的影響

Tb siILK 組與Tb組和Tb vector 組的細(xì)胞相比，Akt 和GSK3β 在細(xì)胞質(zhì)中的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity)無明顯改變，而 p-Akt 和p-GSK3β的平均熒光強(qiáng)度則明顯減弱(圖2);與體外實(shí)驗(yàn)相似，在移植瘤組織切片中，Tb siILK 組的p-Akt和p-GSK3β的平均熒光強(qiáng)度也明顯減弱(圖3);在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，前述各指標(biāo)在Tb組和Tb vector 組之間表達(dá)情況相似。

2.3 ILK siRNA對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響

Tb組和Tb vector 組裸鼠于接種后3 d 開始成瘤;Tb siILK 組于接種后5 天開始成瘤。5周后處死裸鼠，取出瘤體并稱其質(zhì)量。Tb siILK組(1.68±1.35)g 較Tb組(3.58±1.04)g 與Tb vector組(3.64±0.65)g，瘤體質(zhì)量顯著降低(P＜0.05)，抑瘤率分別為53.0%和53.8%(圖4)。

2.4 移植瘤組織學(xué)觀察

Tb組和Tb vector 組移植瘤組織內(nèi)可見壞死及出血灶，癌細(xì)胞體積大而不均勻，核分裂相較多，核質(zhì)比增大，而Tb siILK 組癌細(xì)胞較前2 組體積減小，核分裂相較少，核質(zhì)比例縮小(圖5)。

2.5 ILK siRNA對(duì)裸鼠移植瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移的影響

Tb組和Tb vector 組裸鼠肺組織內(nèi)均發(fā)現(xiàn)自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞巢生成，而Tb siILK 組裸鼠肺組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞巢，各組裸鼠的肺以外器官未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤(圖6)。

2.6 ILK siRNA對(duì)裸鼠移植瘤瘤體微血管的影響

HE 檢查顯示Tb siILK 組瘤組織內(nèi)微血管計(jì)數(shù)(5.6±2.2)/視野較Tb組(15.3±2.3)/視野和Tb vector組(14.6±1.4)/視野組明顯減少(圖5)，免疫熒光檢查顯示Tb siILK 組瘤組織內(nèi)CD31 陽性細(xì)胞明顯較Tb組和Tb vector 組減少(P＜0.05)，與HE 檢查結(jié)果一致(圖7)。

圖2 各組細(xì)胞中Akt，GSK3β，p-Akt 和p-GSK3β的免疫熒光檢查Fig2 In vitro immunofluorescence of Akt，GSK3β，p-Akt and p-GSK3β(×400)

圖3 各組移植瘤中p-Akt 和p-GSK3β的免疫熒光檢查Fig3 In vivo immunofluorescence of p-Akt and p-GSK3β(×200)

圖4 各組移植瘤肉眼檢查Fig4 Morphology of xenograft tumor in each group

圖5 各組移植瘤HE染色Fig5 HE examination for xenograft tumor(×400)

圖6 肺內(nèi)自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤檢查Fig6 Spontaneous metastasis tumor in lung(×100)

圖7 瘤組織微血管免疫熒光檢查Fig7 Immunofluorescence examine of micro blood vessel in xenograft tumor(×200)

3 討論

ILK[3，6]介導(dǎo)由整合素與細(xì)胞外基質(zhì)[7]作用引發(fā)的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，除參與如細(xì)胞生長、分化等基本生理過程，還與腫瘤的血管生成、瘤細(xì)胞黏著、侵襲和遷移等過程密切相關(guān)[8]。研究表明，ILK的表達(dá)和活性在人類多種惡性腫瘤中均明顯升高[9]。抑制ILK 活性，對(duì)消化道、乳腺和膀胱等的腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成可產(chǎn)生抑制作用。有報(bào)道[10]認(rèn)為ILK 對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制存在細(xì)胞特異性，而抑制ILK 對(duì)口腔腫瘤的影響目前罕有報(bào)道。在前期研究中作者發(fā)現(xiàn)，抑制ILK表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的Tb 舌癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移和侵襲能力產(chǎn)生抑制作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移須依賴血管生成提供充足養(yǎng)分和氧氣，本研究證實(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，抑制ILK表達(dá)，腫瘤血管生成也明顯減少，且Tb siILK 組腫瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移受到明顯抑制;Tb siILK 組移植瘤成瘤時(shí)間較Tb組和Tb vector 組延長，成瘤率及瘤體質(zhì)量也較之明顯下降，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)Tb siILK組移植瘤細(xì)胞體積減小，核分裂相較少，核質(zhì)比例縮小;本實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)ILK表達(dá)抑制可對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及血管生成產(chǎn)生抑制作用。

GSK3β 對(duì)維持細(xì)胞的“上皮化狀態(tài)”有重要作用。ILK 通過其磷酸化酶活性對(duì)其下游底物Akt 和GSK3β 進(jìn)行磷酸化。另外ILK 和Akt 均可磷酸化GSK3β 而使之失活，激活A(yù)kt/GSK3β/Snail 通路進(jìn)而介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。抑制ILK 可抑制Akt 和GSK3β的磷酸化，即Akt的活性被抑制而GSK3β的失活被阻止，故抑制ILK 可抑制Akt/GSK3β/Snail 通路。研究證實(shí)抑制ILK 和Akt 活性對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT 現(xiàn)象及肺癌細(xì)胞增殖起到抑制[11-12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制ILK表達(dá)抑制了Tb 舌癌細(xì)胞的Akt 和GSK3β 磷酸化，而對(duì)非磷酸化Akt 和GSK3β的水平無明顯影響，進(jìn)一步證實(shí)了前述發(fā)現(xiàn)，提示ILK 可能通過Akt/GSK3β/Snail 在EMT 現(xiàn)象中起到重要作用。由于ILK信號(hào)通路十分復(fù)雜，本研究將進(jìn)一步檢驗(yàn)抑制ILK 對(duì)其他信號(hào)傳導(dǎo)通路影響，以期深入地闡明抑制ILK 對(duì)舌癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制ILK表達(dá)，體內(nèi)外培養(yǎng)的Tb 細(xì)胞中Akt 和GSK3β的磷酸化受到抑制，移植瘤增殖、血管生成和自發(fā)性轉(zhuǎn)移均受到明顯抑制，提示ILK 有望成為抗腫瘤治療的靶基因。

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