張 曼，施海霞，宋銘晶

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

微衛(wèi)星標記在布氏田鼠封閉群遺傳結構研究中的應用

張 曼，施海霞，宋銘晶

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

目的使用微衛(wèi)星標記分析連續(xù)三代布氏田鼠封閉群遺傳結構的穩(wěn)定性。方法使用高鹽沉淀法從鼠尾中提取布氏田鼠基因組DNA，將篩選出7對微衛(wèi)星引物并用熒光標記(Fam），然后對布氏田鼠封閉群連續(xù)三代的基因組DNA進行PCR擴增，測序儀檢測PCR產物，整理原始數據并對布氏田鼠基因組DNA進行微衛(wèi)星分析。結果 由平均有效雜合度和多態(tài)信息含量的分析得出該布氏田鼠種群傳代過程中保持著較高而且穩(wěn)定的雜合度。結論該實驗結果說明本實驗室布氏田鼠封閉群的遺傳結構比較穩(wěn)定。

布氏田鼠;封閉群;遺傳結構;微衛(wèi)星DNA標記

2007年從中國農業(yè)大學引入了已在室內隨機交配3年的布氏田鼠(Brandt’s vole，lasiopodomys brandtii）普通級實驗室種群，在本實驗室連續(xù)繁殖3年，并對該種群進行了系統(tǒng)藥物凈化和同胞選擇篩選。2011～2013年經清潔級實驗動物微生物和寄生蟲學檢測達到了清潔級的標準［1］，到目前已建立了連續(xù)繁殖8代的清潔級布氏田鼠遠交系(封閉群），同時2013年我們嘗試使用剖腹產凈化和SPF級ICR雌鼠代乳得到凈化的布氏田鼠仔鼠，剖腹產子代通過了SPF級的檢測，說明本實驗室有繁育和凈化得到SPF級布氏田鼠的能力［2］。

封閉群遺傳結構的穩(wěn)定是該封閉群維持遺傳背景清晰和優(yōu)質的必要條件，因此我們利用微衛(wèi)星標記(simple sequence repeats，SSR）技術檢測布氏田鼠封閉群連續(xù)三代(F6～F8）的遺傳結構的穩(wěn)定性，分析布氏田鼠封閉群遺傳結構的變化，進而推測在傳代中種群大小的變化，對等位基因多樣性的影響。最終，我們旨在通過SSR檢測和合理繁育配對建立經濟高效的布氏田鼠封閉群的傳代體系。

SSR標記是被廣泛應用并為學者認可的檢測不同動物種群遺傳多態(tài)性的有效工具［3］，蔡磊等［4］檢測采集于廣東深圳大鵬灣淺水區(qū)的諸氏鯔蝦虎魚的平均多態(tài)信息指數(polymorphism information content，PIC）為0．447;安徽大學籠養(yǎng)的野外種群獼猴的平均PIC值為0．730［5］。而實驗室內的實驗動物種群也利用PIC值作為其遺傳多態(tài)性的重要檢測指標之一，李芳芳［6］等研究的兩個豚鼠封閉群(1994年引自日本，封閉至今;2004年引自Charles River）的平均PIC值為0．552;班建榮等［7］檢測引自蘭州公司實驗動物室并連續(xù)封閉6年的SPF級KM小鼠封閉群PIC值為0．368～0．830;申幸嬌等人檢測來自北京三個單位的封閉群兔(SPF級日本大耳白兔，SPF級新西蘭白兔，SPF級青紫藍兔）平均PIC值為0．410、0．549、0．470［8］。但還未見有學者嘗試運用SSR標記檢測連續(xù)傳代的封閉群的遺傳穩(wěn)定性，從而探索將野生種群在實驗室內以最優(yōu)的繁育規(guī)模繁育，以實現該動物的實驗動物化，因此本實驗為田鼠類動物封閉群的建立和實驗動物化研究提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1．1．1 實驗動物

清潔級的布氏田鼠飼養(yǎng)在獨立送排風凈化動物籠(individually ventilated cage，IVC）中，飼養(yǎng)室溫度22℃ ～25℃，濕度50% ～70%，光照條件14L： 10D，自由攝食和飲水。動物飲水、墊料和籠具均經高壓滅菌處理，飼料經CO60照射消毒達到SPF級動物飼料標準。飼料生產許可證編號【SCXK(京） (2012、2013、2014）－0008】。動物實驗批準號，ILASPG－2014－011。

1．1．2 試劑與儀器

1．1．2．1 試劑

蛋白酶K(SIGMA公司）

Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer(Mg2+）、dNTP、DNA Marker(20 bp）(TaKaRa）

膠回收試劑盒(BIOMIGA公司）

KAPA Taq HotStart擴增試劑(KAPA公司）

1．1．2．2 儀器

7100型全自動生化測定儀(日本日立公司產品），酶標儀(Thermo），ROX－500分子量內標(北京閱微基因技術有限公司），BC－subMIDI電泳儀(北京六一儀器廠），JY300C電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司），NAS－99分光光度計(ACTGene公司），BioSens SC 810B凝膠成像儀(上海山富科學儀器有限公司），GeneAmp 9600 PCR儀(ABI公司），3730XL DNA analyzer(ABI公司）

1.2 實驗方法

1．2．1 DNA的提取

布氏田鼠基因組DNA來自連續(xù)三代的清潔級布氏田鼠幼仔(F6代50只，F7代36只，F8代40只，雌雄各半），采用高鹽沉淀法提取，具體步驟如下：取布氏田鼠尾部組織置于1．5 mL離心管中，加入500 μL鼠尾裂解液(Tris·HCL 10 mmol/L，Na2EDTA 0．1 mol/L，pH8．0配制）和10 μL蛋白酶K(20 mg/mL），55℃消化過夜，待鼠尾組織完全溶解僅有少許尾骨殘骸后，加入300 μL 6 mol/L飽和NaCL混勻，冰上靜置15 min，12000 r/min離心15 min后取上清，加入與上清等體積的異丙醇沉淀DNA，70%乙醇清洗兩次，然后倒掉乙醇自然風干，200 μL TE溶解沉淀，分光光度計檢測DNA濃度，調整樣品濃度至10 ng/μL。

1．2．2 引物的篩選

隨機選取1只布氏田鼠基因組DNA用10條微衛(wèi)星DNA引物［9］進行PCR擴增，用膠回收試劑盒回收目的片段后溶至30 μL無菌水中，取20 μL做基因組測序服務。根據測序結果篩選出與核心序列一致的7條引物，用帶有熒光標記(Fam）的上游引物對布氏田鼠的基因組DNA進行微衛(wèi)星分析。7個布氏田鼠微衛(wèi)星位點及其特征描述見表1。

表1 7個布氏田鼠微衛(wèi)星位點及其特征描述Tab．1 The primer and characteristics of 7 microsatellites loci for Brandt’s voles

1．2．3 PCR反應條件及電泳

利用7對微衛(wèi)星引物對布氏田鼠基因組DNA進行PCR擴增，反應條件如下：10×Buffer(Mg2+），1．5 μL;2．5 mmol/L dNTP，1．2 μL;上游和下游引物(5 μmol/L），1 μL;DNA Taq聚合酶(5 U/μL），0．1 μL;模板DNA，1 μL;3d H2O補齊至15 μL。PCR反應程序為預變性95℃，5 min，1個循環(huán);然后進行35個循環(huán)，包括變性95℃，30 s;退火(各引物最適退火溫度），30 s，延伸72℃，30 s;最后延伸72℃，7 min;之后進入4℃保存。PCR產物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．2．4 3730 XL測序儀檢測

在96孔板中每孔加入分子量內標和甲酰胺混合液(0．5：8．5）9 μL，PCR產物1 μL，輕輕混勻后進行上機檢測，95℃變性3 min。

1．2．5 數據統(tǒng)計和分析

2 結果

2.1 微衛(wèi)星引物擴增及多態(tài)性

選取7個微衛(wèi)星座位檢測三代布氏田鼠封閉群的遺傳多態(tài)性，發(fā)現DQ886927座位有12個等位基因，DQ886932座位有11個等位基因，DQ886926座位有10個等位基因，DQ886925座位有9個等位基因，具有豐富的多態(tài)性，DQ886929和DQ886930座位各有7個等位基因，DQ886934座位最少，為4個等位基因。7個微衛(wèi)星座位的平均等位基因數為8．57個。

2.2 雜合度和多態(tài)信息含量

三代布氏田鼠種群7個基因座位的觀測等位基因數(observed number of alleles）、Ho、He和PIC值見表2。由表2中可以計算出，F6代布氏田鼠種群7個不同座位的平均期望雜合度為0．606，F7代布氏田鼠種群 7個不同座位的平均期望雜合度為0．512，F8代布氏田鼠種群7個不同座位的平均期望雜合度為0．507。

3 討論

目前常用的分子標記技術主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP和EST技術等。RFLP標記為顯性遺傳，但對DNA多態(tài)性的檢出靈敏度不高;RAPD技術為顯性遺傳，不能識別雜合子位點;AFLP技術對基因組純度和反應條件要求較高［10－11］;SNP技術和EST技術多用于大規(guī)模的DNA序列檢測［12］。較之于上述5種分子標記技術，微衛(wèi)星DNA分布廣泛，為共顯性標記，具有較高的多態(tài)性和重復性，對DNA的濃度要求不高，可提供高分辨率的遺傳信息，適合于個體水平和種群水平上遺傳結構的研究［13］。

表2 三代布氏田鼠種群7個基因座位的遺傳特點Tab．2 Genetic characterisitics of 7 microsatellite locus in three generations of Brandt’s voles

目前國內沒有國家標準或行業(yè)標準作為指導實驗動物封閉群遺傳多樣性的建立和維持的規(guī)范。He和PIC值是評價種群遺傳多態(tài)性量化的主要指標，一般He或PIC值越大，該基因座位雜合子的比例就越大，攜帶的遺傳信息量就越大。本研究中，7個微衛(wèi)星座位各自在連續(xù)三代的布氏田鼠種群傳代下的平均PIC和He值分別為DQ886925：0．606和0．652;DQ886926：0．507和0．538;DQ886927：0．669和0．699;DQ886929：0．306和 0．354;DQ886930： 0．385 和 0．412;DQ886932：0．672 和 0．702; DQ886934：0．350和0．434，說明本實驗室連續(xù)繁殖6代以上的布氏田鼠種群的平均PIC值在0．306～0．672，平均He值在0．354～0．702。同有關學者研究的種群的遺傳多態(tài)性相比較，如：C Marchi等［14］2007～2008年研究丹麥兩個農業(yè)區(qū)域和一個自然區(qū)域的東方田鼠種群(He：0．671～0．835）、Magdalena Mikowska［15］2009年取自小島、大陸、重金屬污染區(qū)共10個地域的堤岸田鼠種群(He：0．578～0．869）、Claudia Melis等［16］2006年在挪威北部的14個水鼠種群(He：0．115～0．486）等，本實驗室的布氏田鼠封閉群在實驗室繁育規(guī)模較小的情況下，也沒有發(fā)生明顯的遺傳漂變。并且genepop4．2的 Hardy－Weinberg test分析得出三代布氏田鼠種群均達到平衡狀態(tài)，因此可以判定該群體在傳代過程中保持著合格封閉群的遺傳結構。

總之，本研究表明該布氏田鼠封閉群在連續(xù)傳代過程中保持著穩(wěn)定的遺傳結構和高度的遺傳多態(tài)性，該結論為我們建立最優(yōu)化的傳代體系提供了重要的理論支撐。鑒于目前國內還沒有對封閉群的遺傳多樣性有指導性的要求，本研究在25對繁育籠的情況下，保持了該封閉群的遺傳多態(tài)的穩(wěn)定性，為田鼠類野生動物的引種和繁育提供了借鑒。

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Applications of microsatellite marker technology in the genetic structure research for closed colony of Brandt’s voles

ZHANG Man，SHI Hai－xia，SONG Ming－jing
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China）

Objective Analysis of the genetic structure stability of Brandt’s vole(lasiopodomys brandtii）in closed colony using microsatellite marker technology．Methods Genomic DNA was extracted from tail tip using highconcentration－salt precipitation methods．Marked with fluorescent tags(Fam），7 microsatellite primers were filtered out by PCR，and the DNA structure of three consecutive generations of Brandt’s vole was analyzed by microsatellite marker．Results By the analysis of the average heterozygosity and polymorphism information content，Brandt’s vole populations maintaineda closed group of qualified genetic structure．Conclusions The present results show that the closed group of Brandt’s vole species in our laboratory maintain a stable genetic structure．

Brandt’s vole;Closed colony;Genetic structure;Microsatellite DNA marker

R－332

A

1671－7856(2015）07－0034－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．008

國家自然科學基金項目(31301890）;北京市自然科學基金資助項目(7122110）。

張曼(1989－），女，碩士生，研究方向實驗動物學。E－mail：zh_man89@foxmail．com。

宋銘晶，博士，副研究員。E－mail：songmj@cnilas．org

2015－05－28）