朱栩棟，姚 超，龔松迪，何立鋒，李曉燕，張玲玲

(杭州師范大學(xué)，杭州311121）

衰老對(duì)小鼠肺干細(xì)胞修復(fù)能力的影響

朱栩棟，姚 超，龔松迪，何立鋒，李曉燕，張玲玲

(杭州師范大學(xué)，杭州311121）

目的 研究衰老對(duì)小鼠肺組織干細(xì)胞在生理狀態(tài)和支氣管上皮細(xì)胞(Clara細(xì)胞）損傷后修復(fù)能力的影響。方法通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)老齡和低齡組小鼠的肺組織干細(xì)胞比例進(jìn)行分析，研究衰老對(duì)肺組織干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持的影響;通過(guò)免疫組化染色對(duì)肺組織病理切片進(jìn)行分析，確立支氣管上皮細(xì)胞(Clara細(xì)胞）損傷模型;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化染色、肺組織病理切片研究老齡和低齡組小鼠在支氣管上皮細(xì)胞(Clara細(xì)胞）損傷后肺組織干細(xì)胞的損傷修復(fù)能力。結(jié)果 老齡組肺組織干細(xì)胞比例(肺上皮干細(xì)胞/前體細(xì)胞，肺間質(zhì)干細(xì)胞/前體細(xì)胞）在穩(wěn)態(tài)維持的情況下較低齡組改變不顯著;在肺支氣管上皮細(xì)胞(Clara細(xì)胞）損傷后，老齡組小鼠支氣管上皮出現(xiàn)較嚴(yán)重的細(xì)胞受損;在接下來(lái)的觀察中發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織前體細(xì)胞/肺組織總細(xì)胞比例在老齡組顯著下降，且增殖細(xì)胞在肺組織前體細(xì)胞和肺組織干細(xì)胞中的比例出現(xiàn)顯著下降;同時(shí)，小鼠支氣管上皮恢復(fù)程度在老齡組明顯較差。結(jié)論在穩(wěn)態(tài)維持的狀態(tài)下，衰老對(duì)肺組織干細(xì)胞的比例沒(méi)有影響。在支氣管上皮細(xì)胞受到損傷后，肺組織干細(xì)胞占肺總細(xì)胞比例降低，修復(fù)與再生能力顯著下降?？赡転榕R床上衰老更易產(chǎn)生肺組織損傷及病變更嚴(yán)重的原因。

肺損傷修復(fù);衰老;流式細(xì)胞術(shù);肺干細(xì)胞

在我國(guó)，呼吸系統(tǒng)疾病的致死率僅次于心腦血管和惡性腫瘤，位居我國(guó)居民死亡原因的第三位。人口老齡化是影響呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要因素。肺干細(xì)胞在肺組織損傷修復(fù)和穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用［1－3］。呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生時(shí)可能存在著肺干細(xì)胞增殖分化和穩(wěn)態(tài)維持的失衡［1，4］。在衰老過(guò)程中，肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，通氣功能逐漸減弱，但是衰老是否影響了肺干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持和損傷修復(fù)能力尚不清楚。

小鼠的肺組織由多種細(xì)胞組成，其中上皮細(xì)胞包括基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、刷細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、Clara細(xì)胞、Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等。Clara細(xì)胞被認(rèn)為是遠(yuǎn)端支氣管上皮的一種主要細(xì)胞，主要分布在小鼠的遠(yuǎn)端細(xì)支氣管上皮。Clara細(xì)胞占小鼠支氣管上皮細(xì)胞數(shù)目的89．5%，人類(lèi)的終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的(11±3）%，人類(lèi)呼吸性細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的(22±5）%，隨著支氣管內(nèi)徑的減小，其比例逐漸增多［5］。

肺臟具有一定程度的再生能力，在肺損傷發(fā)生時(shí)可通過(guò)局部的修復(fù)來(lái)維持組織的結(jié)構(gòu)和功能。這是由肺干細(xì)胞在損傷后進(jìn)一步分化、增殖，替代受損傷的細(xì)胞，維持著肺上皮組織的穩(wěn)定。參與肺組織的再生和損傷修復(fù)的肺干細(xì)胞主要存在兩種類(lèi)型：肺上皮干細(xì)胞和肺間質(zhì)干細(xì)胞。我們利用萘特異性損傷Clara細(xì)胞，建立支氣管上皮細(xì)胞損傷模型。觀察肺組織干細(xì)胞對(duì)年輕和衰老兩種狀態(tài)下在支氣管上皮細(xì)胞損傷后的穩(wěn)態(tài)維持能力。由于目前尚無(wú)公認(rèn)的肺干細(xì)胞表面標(biāo)記，對(duì)肺組織干細(xì)胞的來(lái)源亦是眾說(shuō)紛紜［2］。近幾年來(lái)，研究人員利用流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)肺組織干細(xì)胞進(jìn)行分析和分選，極大地方便了對(duì)肺衰老和組織損傷修復(fù)過(guò)程的研究［6－8］。因此，本研究中利用流式細(xì)胞技術(shù)觀察衰老過(guò)程中肺組織干細(xì)胞數(shù)量和構(gòu)成的改變，觀察肺支氣管上皮細(xì)胞損傷模型修復(fù)過(guò)程中肺干細(xì)胞的改變，了解衰老對(duì)肺組織干細(xì)胞在肺支氣管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)中的影響。

1 材料和方法

1.1 肺組織單細(xì)胞懸液的制備：

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，制備肺組織單細(xì)胞懸液［6］，每個(gè)樣品準(zhǔn)備1 mg/mL膠原酶Ⅰ溶于無(wú)菌的PBS中，預(yù)熱至37℃。脫頸處死小鼠，打開(kāi)腹腔，下腔靜脈放血。打開(kāi)胸腔，取肺，放入裝有冷的PBS的15 mL離心管中。在這一步驟中，將肺部的支氣管去除，只留下肺的遠(yuǎn)端細(xì)胞。在離心管中輕輕攪動(dòng)肺葉，去除多余的血液直至肺組織變白，用眼科剪將肺剪碎，剪碎的組織放入15 mL離心管內(nèi)，加入預(yù)熱的3 mL膠原酶溶液。將離心管放在thermo的混勻器上750 r/min，37度震蕩0．5 h。5 mL注射器吹打懸液，使大塊結(jié)締組織分離，在混勻器上750 r/min，37度繼續(xù)震蕩0．5 h，1 mL注射器吹打懸液，使細(xì)胞分離，0．22 μm濾膜過(guò)濾，制備單細(xì)胞懸液，1400 r/min離心5 min，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，去除紅細(xì)胞。

1.2 肺干細(xì)胞流式分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的研究方法［6，9］，以 CD31－CD45－Sca－1+CD34+作為肺干細(xì)胞的表面標(biāo)記，CD31－CD45－Sca－1+CD34+EpCAM－作為肺間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記;CD31－CD45－Sca－1+CD34+EpCAM+作為肺上皮干細(xì)胞標(biāo)記。將 CD31－Biotin，CD45－Biotin，SA－PE/FITC，Sca－1－PE－Cy7抗體用稀釋液10倍稀釋;肺組織細(xì)胞懸液離心后去上清，保留終體積約50 μL。加入CD31－Biotin(1－10）10 μL，CD45－Biotin(1－10）10 μL，冰上孵育30 min;加入抗體稀釋液2 mL，1500 r/min離心5 min;去上清，終體積50 μL。加入SA－PE(1－10）15 μL，Sca－1－PE－Cy7(1－10），APC－Epicam(1－10）稀釋液10 μL，CD34－FITC 3μL冰上孵育45 min;加入稀釋液2 mL，用50 μm濾膜過(guò)濾，1500 r/min離心，5 min;去上清，加入抗體稀釋液300 μL混勻;利用流式細(xì)胞儀分析肺上皮干細(xì)胞的比例。

1.3 萘致肺Clara細(xì)胞損傷模型的制備

我們將C57 BL/6J野生型小鼠根據(jù)年齡分為兩組，老齡組(＞72周齡）和低齡組(8～16周齡），每組8只。對(duì)年輕和年老組小鼠給予275 mg/kg萘(用玉米油溶解）腹腔注射，同年齡對(duì)照組小鼠給予等體積的玉米油腹腔注射。3～7 d后取小鼠肺組織實(shí)驗(yàn)。SPF級(jí)C57 BL/6J小鼠，來(lái)源于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(浙）2011－0048】。萘致肺Clara細(xì)胞損傷模型構(gòu)建在杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行【SYXK(浙）2011－0157】。

1.4 蘇木素-伊紅染色

將小鼠脫頸處死，分離肺組織取右下肺葉，固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后石蠟包埋。進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，厚度5 μm。切片固定到載玻片上。切片脫水后，進(jìn)行蘇木素伊紅染色。

1.5 免疫熒光染色：

將小鼠脫頸處死，分離肺組織取右下肺葉，固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后石蠟包埋。進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，厚度5 μm。切片固定到載玻片上。對(duì)石蠟切片進(jìn)行胞內(nèi)抗原CCSP染色，觀察肺損傷修復(fù)過(guò)程中Clara細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)［10］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較采用student t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 衰老對(duì)小鼠肺組織干細(xì)胞比例的影響

為研究衰老狀態(tài)是否會(huì)影響小鼠遠(yuǎn)端肺干細(xì)胞占肺總細(xì)胞的比例，我們對(duì)遠(yuǎn)端肺干細(xì)胞在老齡組和低齡組的比例進(jìn)行了分析(圖1A－B）。分離肺組織，采用CD31－CD45－Sca－1－EpCAM+標(biāo)記肺上皮干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析比例。結(jié)果表明肺上皮干細(xì)胞(CD31－CD45－Sca－1－EpCAM+）(老齡組37．02%±6．58%，低齡組36．12% ±0．61%）和肺間質(zhì)干細(xì)胞(CD31－CD45－Sca－1+EpCAM－）(老齡組10．46%±4．36%，低齡組9．85%±2．31%）在肺總細(xì)胞中所占比例在老齡組和低齡組之間無(wú)顯著差異。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EpCAMhi標(biāo)記細(xì)胞屬于上皮干細(xì)胞，將其進(jìn)行體外培養(yǎng)，可生成上皮細(xì)胞樣克隆球［11］。根據(jù)該文獻(xiàn)，我們將 EpCAM+(CD31－CD45－Sca－1－EpCAM+）細(xì) 胞 分 為 EpCAMhi，EpCAMmed，EpCAMlow三群 (圖1A）。其中EpCAMhi(老齡組 4．75% ±1．23%，低齡組 4．81% ± 4．72%），EpCAMmed(老齡組22．5%±4．98%，低齡組19．78%±0．97%），EpCAMlow(老齡組9．18%± 1．13%，低齡組12．29%±3．26%）細(xì)胞群并未在衰老組中出現(xiàn)顯著差異(P＞0．05）(圖1B）。說(shuō)明在正常生理穩(wěn)態(tài)下，衰老并不影響在遠(yuǎn)端肺組織中干細(xì)胞的比例。

2.2 肺支氣管上皮損傷小鼠模型的建立及肺組織干細(xì)胞修復(fù)能力的觀察

2．2．1 肺支氣管上皮損傷小鼠模型的建立

利用Clara細(xì)胞的萘易損傷的特性，建立小鼠的支氣管上皮細(xì)胞特異性損傷模型。對(duì)小鼠進(jìn)行萘的腹腔注射，在支氣管氣道上皮中可選擇性地去除表達(dá)CCSP的Clara細(xì)胞。萘處理3 d后的肺組織進(jìn)行HE染色，觀察標(biāo)本，可見(jiàn)Clara細(xì)胞在細(xì)支氣管上皮形成空泡，部分部位出現(xiàn)脫落。上皮結(jié)構(gòu)受到破壞，不完整，有斷裂出現(xiàn)(彩插3圖2）。

2．2．2 肺支氣管上皮損傷小鼠模型的修復(fù)能力

萘損傷7 d后，觀察肺支氣管上皮是否進(jìn)行了修復(fù)，可見(jiàn)Clara細(xì)胞的萘特異性損傷依然存在，同時(shí)出現(xiàn)部分修復(fù)(彩插3圖3）。

圖1 年輕、年老小鼠遠(yuǎn)端肺組織干細(xì)胞的比例比較Note：(A）The FSC schematic diagram．(B）Comparison of the proportion of lung stem cells between young and old group．EpCAMhimeans the proportion of CD31－CD45－Sca－1+EpCAMhicells to total lung cells;EpCAMmedmeans the proportion of CD31－CD45－Sca－1+EpCAMmedcells to total lung cells;EpCAMlowmeans the proportion of CD31－CD45－Sca－1+EpCAMlowcells to total lung cells;EpCAM+(lung epithelial stem cells/total lung cells）：CD31－CD45－Sca－1+EpCAM+cells to total lung cells;Sca－1+(lung mesenchymal stem cells/total lung cells）：CD31－CD45－Sca－1+EpCAM－cells to total lung cells．OLD：old group(n=8），YOUNG：young group(n=8）．Fig．1 The number of lung stem cells in total distal lung cell in young and old group mice

2.3 衰老對(duì)支氣管上皮損傷損傷修復(fù)的影響(圖見(jiàn)彩插4）

2．3．1 年輕和年老萘損傷模型的肺組織病理改變

將C57BL/6J小鼠分為老齡組(＞72周齡）和低齡組(8～16周齡），每組各8只。進(jìn)行萘的腹腔注射(200 mg/kg）。將肺組織的石蠟切片進(jìn)行HE染色(圖4A－D）。細(xì)支氣管上皮細(xì)胞在老齡對(duì)照組(未經(jīng)萘處理組）(圖4B）較低齡組(圖4A）變薄，在上皮細(xì)胞中未觀察到脫落及死亡。在萘損傷組中，(圖4C－D）我們發(fā)現(xiàn)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)部分脫落及破壞，間隙變大;老齡組(圖4D）肺上皮細(xì)胞大部分出現(xiàn)脫落，破壞嚴(yán)重;低齡組(圖4C）則表現(xiàn)較輕，具體為細(xì)胞間隙增大，少量脫落。對(duì)肺組織進(jìn)行免疫熒光染色，CCSP特異性標(biāo)記細(xì)支氣管上皮(Clara細(xì)胞）細(xì)胞(圖4E－H）。染色顯示萘可特異性損傷支氣管上皮Clara細(xì)胞。老齡組損傷更明顯(圖4H），3 d后即可看到大部分Clara脫落，死亡。甚至細(xì)支氣管上皮層出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞;與此同時(shí)，低齡組Clara細(xì)胞仍可見(jiàn)。(圖4G）。

2．3．2 年輕和年老小鼠肺支氣管上皮損傷修復(fù)過(guò)程中肺干細(xì)胞的分析

肺支氣管上皮損傷模型建立后，我們對(duì)遠(yuǎn)端肺干細(xì)胞在老齡和低齡組中的的比例進(jìn)行了分析。具體如下，老齡組(＞72周齡）和低齡組(8～16周齡）的C57 BL/6J野生型小鼠各8只，萘處理特異性損傷肺支氣管上皮細(xì)胞。用CD31－CD45－Sca－1+CD34+對(duì)在處理7 d的小鼠肺組織進(jìn)行上皮干細(xì)胞表面標(biāo)記，同時(shí)用BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞，并在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析(圖5）。結(jié)果顯示萘處理后老齡組較低齡組小鼠肺前體細(xì)胞(CD31－CD45－）/肺總細(xì)胞比值(老齡組12．24%±2．53%，低齡組18．74% ±2．05%）及肺組織干細(xì)胞(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）/肺總細(xì)胞比值(老齡組0．89% ±0．13%，低齡組1．38%±0．15%）均出現(xiàn)顯著降低。無(wú)論是肺前體細(xì)胞(CD31－CD45－）(老齡組 8．21% ± 1．46%，低齡組12．57%±1．59%）還是肺組織干細(xì)胞(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）(老齡組6．85% ± 0．46%，低齡組8．57%±0．89%）中增殖細(xì)胞所占比例低齡組明顯高于老齡組(P ＜0．05）。該數(shù)據(jù)提示損傷后，低齡組的干細(xì)胞增殖能力在修復(fù)過(guò)程中較老齡組高。

圖5 A．肺支氣管上皮損傷后老齡組和低齡組肺前體細(xì)胞(CD31－CD45－）和肺組織干細(xì)胞(CD31－CD45－Sca－1+ CD34+）占肺組織總細(xì)胞比例;B．肺支氣管上皮損傷后老齡組和低齡組肺前體細(xì)胞(CD31－CD45－）中增殖細(xì)胞和肺組織干細(xì)胞(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）中增殖細(xì)胞所占比例。OLD為老齡組(n=8），YOUNG為低齡組(n=8）;*為P＜0．05Fig．5 A．The proportion of progenitor cells(CD31－CD45－）;lung stem cells(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）to total lung cell in different ages mice after naphthalene treatment．B．The proportion of BRDU positive cell in CD31－CD45－Sca－1+CD34+ and CD31－CD45－Sca－1+CD34+cell．OLD：the old group(n=8）;YOUNG：the young group(n=8）．*：P＜0．05

3 討論

肺組織衰老的發(fā)生過(guò)程和衰老過(guò)程中肺臟相關(guān)的各種疾病的致病機(jī)制仍有待深入研究。成體干細(xì)胞在組織再生中具有重要作用，越來(lái)越多的研究表明衰老與干細(xì)胞功能的下降密不可分［12－15］。隨著干細(xì)胞生物學(xué)方法的建立，關(guān)于其研究也在不斷深入。在肺臟相關(guān)疾病及損傷修復(fù)過(guò)程中肺組織干細(xì)胞所扮演的角色也越來(lái)越受到人們的重視。肺干細(xì)胞的體外培養(yǎng)為相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展體外研究提供了模型，并為干細(xì)胞在肺相關(guān)疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)［3］。但肺干細(xì)胞由于標(biāo)記物不明確而延緩了其相關(guān)的研究，研究報(bào)道表明肺間質(zhì)和上皮干細(xì)胞可以使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行篩選［6］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道我們采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肺干細(xì)胞進(jìn)行了表面標(biāo)記。研究在衰老變化中成體肺組織干細(xì)胞的自我更新和分化能力，以期探討成體干細(xì)胞在肺組織器官的衰老和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生中的作用。

在生理狀態(tài)下，肺干細(xì)胞擁有有限的增殖能力，為了發(fā)掘肺干細(xì)胞的增殖潛力，我們建立了肺上皮細(xì)胞損傷模型。萘能夠特異性損傷小鼠支氣管上皮Clara細(xì)胞，我們利用該動(dòng)物模型來(lái)研究肺干細(xì)胞在肺衰老生理狀態(tài)及肺上皮細(xì)胞損傷過(guò)程中再生修復(fù)能力。研究顯示衰老在生理狀態(tài)下對(duì)肺干細(xì)胞(包括遠(yuǎn)端肺上皮干細(xì)胞和肺間質(zhì)干細(xì)胞/肺總細(xì)胞）的比例影響不明顯。而在小鼠肺支氣管上皮(Clara）細(xì)胞特異性損傷修復(fù)過(guò)程中，肺上皮干細(xì)胞和肺間質(zhì)干細(xì)胞/肺總細(xì)胞的比例出現(xiàn)下降。為了進(jìn)一步比較損傷修復(fù)狀態(tài)下年輕和年老小鼠肺組織干細(xì)胞修復(fù)能力的差異，我們通過(guò)BrdU染色對(duì)肺組織干細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)老齡組較低齡組的肺干細(xì)胞增殖比例下降，表明在衰老顯著影響了肺上皮細(xì)胞損傷后肺干細(xì)胞修復(fù)的能力。由此可見(jiàn)，在正常生理狀態(tài)下衰老對(duì)以肺干細(xì)胞比例為代表的肺干細(xì)胞表型沒(méi)有影響，而一旦在應(yīng)激狀態(tài)下(Clara細(xì)胞受損）肺干細(xì)胞不僅出現(xiàn)比例下降的表型且增殖能力也存在明顯的減弱趨勢(shì)。該研究發(fā)現(xiàn)揭示了衰老狀態(tài)下肺組織干細(xì)胞尚能保持穩(wěn)態(tài)維持，但在損傷后的對(duì)肺組織的修復(fù)卻無(wú)能為力。該發(fā)現(xiàn)為肺組織衰老和肺組織干細(xì)胞的研究提供了理論依據(jù)，并為干細(xì)胞在特異性組織器官衰老預(yù)防及治療提供了研究思路。

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Effect of aging on repair capability of lung stem cells

ZHU Xu－dong，YAO Chao，GONG Song－di，HE Li－feng，LI Xiao－yan，ZHANG Ling－ling
(Hang Zhou Normal University，Hangzhou 311121，China）

Objective To study the impact of aging on the capability of lung stem cell steady－state maintaining and bronchial epithelial cells regeneration and differentiation during the repair of lung epithelial cells after naphthalene induced bronchial epithelialium injury．Methods The proportion of lung stem cells in mice after naphthalene treatment was analyzed by immunohistochemistry and FACS．The repair efficiency of lung epithelial cell in young and old mice was examined by immunohistochemistry staining and FACS．Results The data suggested that aging didn’t change the proportion of lung stem cells(including the distal lung epithelial stem cells/progenitor cells and lung mesenchymal stem cells/progenitor cells）under normal physiological conditions．After naphthalene injury，more serious injury and decreased repairing capacity was observed in old group．Lung progenitor cells/total lung cells decreased during the repair process of lung bronchial epithelialium(clara cell）injury．The ratio of regenerated cell to lung progenitor and stem cells were also significantly decreased in old group．Conclusion The regenerated capability of lung stem cells after lung bronchial epithelialium injury decreased with aging．This might be the reason of more incidence of lung injury and worse therapeutic results in the elder in clinic．

Lung damage and repair;Aging;FACS;Lung stem cell

R－332

A

1671－7856(2015）07－0025－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．006

國(guó)家自然科學(xué)基金(81300264）;2012年度浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃(新苗人才計(jì)劃2012R4210007）。

朱栩棟(1987－），男，講師。

張玲玲(1982－），女，講師，博士，研究方向：衰老與成體干細(xì)胞。E－mail：zhangll821025@163．com。

2015－07－02