劉 靜,田海梅,李艷芬,李 茉,王小兵,張 偉

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院生物檢測中心，北京 100021）

放射耐受性人小細(xì)胞肺癌亞株的建立

劉 靜,田海梅,李艷芬,李 茉,王小兵,張 偉

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院生物檢測中心，北京 100021）

目的 建立肺癌NCI-H446細(xì)胞放射抗拒性亞株，為小細(xì)胞肺癌放射抗拒和逆轉(zhuǎn)研究提供配對(duì)的細(xì)胞研究工具。方法 通過梯度照射NCI-H446細(xì)胞株誘導(dǎo)其耐放射性（共7500cGy），并通過檢測細(xì)胞總的ATP含量的方法來監(jiān)測細(xì)胞倍增時(shí)間，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，以及應(yīng)用多靶單擊模型SF=1-（1-e-D/D0）N擬合細(xì)胞存活曲線分析其放射敏感參數(shù)的變化。結(jié)果 比較親本與耐放射株的差異，放射生物學(xué)參數(shù)值分別為D0（1.9673，2.2756）、N（1.0016，2.6008）、Dq（0.6783，1.6860）、SF2（0.3623，0.7134），耐放射株SF2值為親本的1.97倍，G2/M期細(xì)胞所占比由18.52％下降到7.84％。耐放射株的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，倍增時(shí)間比敏感株延長。結(jié)論 通過梯度照射建立了小細(xì)胞肺癌NCI-H446的耐放射亞株NCI-H446-R，與親本細(xì)胞相比放射生物學(xué)參數(shù)有顯著差異（P＜0.05），本研究成果為研究小細(xì)胞肺癌放射抗拒及耐放射逆轉(zhuǎn)提供了新的細(xì)胞模型。

放射抗拒；小細(xì)胞肺癌；NCI-H446細(xì)胞株；細(xì)胞周期

由于環(huán)境污染日益加劇、吸煙等原因，肺癌已持續(xù)成為世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率仍呈上升趨勢，據(jù)《2012中國腫瘤登記年報(bào)》發(fā)布，從全國來看，肺癌居惡性腫瘤發(fā)病的第一位，每10萬人約有 54人會(huì)患肺癌，占惡性發(fā)病率的18.74％，男性為女性的1.94倍［1]，極大威脅著人類的健康和生命。肺癌的病理類型中小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占肺癌發(fā)病總數(shù)的20％～25％。由于SCLC細(xì)胞倍增時(shí)間短、進(jìn)展快，與其他腫瘤不同之處就是早期即傾向于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，主要采取以放化療為主的綜合治療［2]。然而，部分SCLC患者對(duì)放療不敏感，放療后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線抗拒是影響SCLC放療效果的主要因素。

SCLC的放療抗拒研究對(duì)提高肺癌的預(yù)后具有重要價(jià)值，國內(nèi)已有分子和細(xì)胞水平的研究報(bào)道，但不足之處是細(xì)胞研究模型不統(tǒng)一且來源各不相同，尤為關(guān)鍵的是尚未穩(wěn)定成株的肺癌細(xì)胞株并缺乏必要的參數(shù)鑒定。本研究選擇來自 ATCC （american type culture collection）的小細(xì)胞肺癌NCIH446細(xì)胞株作為親本細(xì)胞系，體外通過序貫輻射誘導(dǎo)的方法，誘導(dǎo)獲得具有放射抗拒性的細(xì)胞亞株NCI-H446-R并穩(wěn)定傳代。同時(shí)，研究和摸索建立耐放射細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)方法，為其他耐放射細(xì)胞系的建立提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 輻射誘導(dǎo)

應(yīng)用醫(yī)用電子直線加速器（X射線），品牌：Clinac 600C/D（由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院加速器室提供使用），由低劑量到高劑量按照2Gy、5Gy、8Gy、10Gy的順序逐漸增加放射劑量，一次照射完成細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)后，繼續(xù)下一次照射。照射次數(shù)共12次，照射總劑量7500cGy，分別為：（2Gy×3次，5Gy ×3次，8Gy×3次，10Gy×3次），劑量率300cGy/min，射野大?。?0 cm×10 cm，細(xì)胞瓶表面覆有約1.5 cm厚的補(bǔ)償膜，照射后4 h換新鮮培養(yǎng)液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NCI-H446細(xì)胞株來自ATCC，由本中心常規(guī)保存。 采 用 10％ FBS（Hyclone SH30084.03），RPMI1640（Gibco 31800105）培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱（Forma Model3111）中培養(yǎng)。照射后根據(jù)細(xì)胞密度傳代，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后繼續(xù)下一次照射，照射前凍存部分細(xì)胞保種。

1.3 單克隆篩選細(xì)胞亞株

按照計(jì)劃的放射劑量完成照射后，采用單克隆方法得到耐放射性及生長特性趨于統(tǒng)一的細(xì)胞，從而純化細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25％胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后接種到96孔板上。每日觀察克隆的形成情況，克隆形成后，顯微鏡觀察標(biāo)記出單克隆的孔，消化取出細(xì)胞并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，分別標(biāo)記其亞株名稱。選擇生長狀況良好的一個(gè)亞株并穩(wěn)定傳代30次以上，命名為NCI-H446-R。

1.4 放射敏感參數(shù)測定

通過經(jīng)典的克隆形成實(shí)驗(yàn)，來檢驗(yàn)NCI-H446-R的耐放射性。取對(duì)數(shù)生長期的NCI-H446與NCIH446-R細(xì)胞，胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞后，將細(xì)胞懸浮在含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。細(xì)胞懸液按倍數(shù)稀釋后，每種細(xì)胞設(shè)三個(gè)平行孔2 mL/孔，在標(biāo)記為（0Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy）的不同12孔板中分別按600個(gè)/孔、1000個(gè)/孔、4000個(gè)/孔、8000個(gè)/孔和10000個(gè)/孔接種細(xì)胞，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，4 h后按所標(biāo)記劑量完成照射。照射后在37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2周左右。當(dāng)形成克隆的面積足夠大（單克隆細(xì)胞數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞）且克隆間不相連時(shí)終止培養(yǎng)。棄上清并用PBS小心浸洗2次。加甲醇2 mL，固定15 min，去固定液，加適量Giemsa染色10 min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將12孔板置于顯微鏡下，統(tǒng)計(jì)形成的克隆數(shù)并計(jì)算得出存活分?jǐn)?shù)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。最后應(yīng)用多靶單擊模型繪制細(xì)胞存活曲線。

1.5 細(xì)胞周期測定

誘導(dǎo)的耐放射株經(jīng)最后一次10Gy照射后，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)最終穩(wěn)定傳代成NCI-H446-R細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長期的敏感株與耐放射株細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，每種取約1×106個(gè)細(xì)胞離心去培養(yǎng)基，加75％冰乙醇固定，置于-20℃過夜。次日離心棄上清，PBS洗2次后加PI染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期分部。最后，通過ModFit LT軟件繪制細(xì)胞周期分部圖，對(duì)比親本株和耐放射株的細(xì)胞周期變化情況。

1.6 ATP法繪制細(xì)胞生長曲線

取對(duì)數(shù)生長期的敏感株與耐放射細(xì)胞株，消化細(xì)胞成單個(gè)后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2000個(gè)/mL。設(shè)8個(gè)平行孔，加200 uL/孔細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞株分別接種8塊96孔板，每塊培養(yǎng)板分別標(biāo)注對(duì)應(yīng)的細(xì)胞株名稱及第1天～第8天，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過檢測每個(gè)孔中總的細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）含量的方法（試劑盒購于：北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），來觀察細(xì)胞的增殖情況。每24 h檢測一對(duì)培養(yǎng)板，連續(xù)測8 d，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 放射生物學(xué)參數(shù)

2.2 細(xì)胞周期變化

通過流式細(xì)胞儀測得的數(shù)據(jù)顯示，NCI-H446-R與NCI-H446在細(xì)胞周期分布上存在顯著差異（彩插7圖2）。對(duì)比兩株細(xì)胞的細(xì)胞周期所占比例，NCI-H446-R的G1期與S期細(xì)胞所占比例分別由63.52±8.25％和17.96±2.93％上升到67.94± 6.02％和24.23±2.26％；G2/M期細(xì)胞由18.52± 3.14％下降到7.84±2.19％，結(jié)果顯示耐放射細(xì)胞株G1期和S期比例增多，G2/M期比例減少。

2.3 細(xì)胞生長差異

細(xì)胞在射線照射馴化過程中，會(huì)出現(xiàn)大片死亡脫落，鏡下觀察可見不同程度的細(xì)胞變形增大、多偽足，細(xì)胞內(nèi)外顆粒較多，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡、核變大及多核等特征。隨著照射劑量的不斷加大，細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)的時(shí)間也隨之加長。通過ATP法檢測并繪制細(xì)胞生長曲線（彩插7圖3），NCI-H446約在第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第6天進(jìn)入平臺(tái)期；NCIH446-R在第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第8天進(jìn)入平臺(tái)期。耐放射株的倍增時(shí)間較敏感株延長。在相同的培養(yǎng)條件下，NCI-H446-R的細(xì)胞形態(tài)較其親本株也有所不同。

圖1 多靶單擊擬合模型擬合的NCI-H446＆NCIH446-R細(xì)胞存活曲線

3 討論

目前國內(nèi)外相關(guān)研究者已經(jīng)通過不同的誘導(dǎo)方法建立起多種不同組織來源的耐放射細(xì)胞亞株［3-5]，并對(duì)獲得的耐放射細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)的耐放射性分析。對(duì)于細(xì)胞耐放射性的產(chǎn)生機(jī)制主要有兩種不同的觀點(diǎn)。首先，有觀點(diǎn)認(rèn)為同一細(xì)胞群中即使是同一來源的細(xì)胞也存在著放射敏感性不同的細(xì)胞亞群。即使是同一細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞，在內(nèi)外環(huán)境的不斷作用下，對(duì)放射線的敏感程度也存在差異，放射線選擇性的殺死了放射敏感的細(xì)胞，使放射抗拒的細(xì)胞存活下來并不斷增殖，并使其后代也具有了耐放射性；另外，有學(xué)者認(rèn)為，在照射過程中雖然殺死了大部分的腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)也誘導(dǎo)了部分細(xì)胞突變，使其具有耐放射性并不斷增殖［6]?？傊?，放射線照射后存活的細(xì)胞具有了輻射耐受性，它和親本細(xì)胞是具有同一來源放射敏感性不用的細(xì)胞株。

本研究采用多次照射、逐步增加放射劑量的方法誘導(dǎo)出耐放射性較高的細(xì)胞亞株，總的照射劑量為7500cGy。從細(xì)胞株的初次誘導(dǎo)，到細(xì)胞穩(wěn)定傳代后完成耐放射性鑒定，歷時(shí)16個(gè)月。設(shè)定的照射劑量完成后，通過亞克隆實(shí)驗(yàn)純化出單克隆株，使其生物特性更趨于一致。最后通過經(jīng)典的克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測并計(jì)算其放射生物學(xué)參數(shù)：終斜率D0值、準(zhǔn)閾劑量 Dq值、外推值 N和 SF2。計(jì)算得出，NCI-H446-R的SF2值為其親本株的1.97倍，有顯著差異（P ＜0.05）性。不同細(xì)胞周期對(duì)放射的敏感性也不同，一般S期的細(xì)胞最抗拒，G2/M期對(duì)放射線最敏感［7]。通過流式細(xì)胞儀檢測，NCI-H446-R的G2/M期所占比例為7.84％，親本株為18.52％，存在顯著差異（P ＜0.05）。輻射損傷主要表現(xiàn)為細(xì)胞再增值能力的喪失，細(xì)胞經(jīng)放射線照射后的1～2代之內(nèi)細(xì)胞并未有明顯變化，待傳至2～3代后細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)大片死亡、脫落，發(fā)生有絲分裂性死亡，失去腫瘤的無限增值能力。存活的細(xì)胞在形態(tài)上會(huì)出現(xiàn)顯著的變化，細(xì)胞核質(zhì)比增大，雙核；細(xì)胞內(nèi)顆粒物增多，多空泡；生長速度變慢，代謝加快；細(xì)胞個(gè)體間形態(tài)差異較大，多偽足。傳至8～10代以后，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，趨于統(tǒng)一，增殖速度和代謝水平也逐漸恢復(fù)。最終誘導(dǎo)出的耐放射細(xì)胞株NCI-H446-R，較敏感株在細(xì)胞形態(tài)和倍增時(shí)間上也有所不同，在某種程度上也驗(yàn)證了細(xì)胞周期的檢測結(jié)果。

總之，本研究通過梯度照射法，模擬臨床上耐放射細(xì)胞的形成過程，建立了小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446的放射抗拒性細(xì)胞亞株NCI-H446-R并穩(wěn)定傳代，通過克隆形成等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其耐放射性［9-10]。在未來的工作中，我們將進(jìn)一步利用獲得的放射抗拒細(xì)胞株，來開展有關(guān)小細(xì)胞肺癌放射抗拒及耐放射逆轉(zhuǎn)等相關(guān)研究。

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The establishment of a radiation-resistant small cell lung cancer subline

LIU Jing，TIAN Hai-mei，LIYan-fen，LIMo，WANG Xiao-bing，ZHANGWei
（Tumor Marker Research Center，Cancer Institute＆Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China）

Objective To establish a radiation-resistant cell subline from a human small cell lung cancer（SCLC）cell line NCI-H446，providing a pairing research tool for investigating mechanism of radiation tolerance and the reverse strategy in lung cancer.Methods The NCI-H446 cell was radiated repeatedly by increased dose of radiation gradually （total7500cGy）and a radiation-resistant cell substrain was induced and selected from the survival of cells.The doubling time and cell cycle distribution of the substrain were detected by ATP kit and flow cytometry Assay respectively；Radiation biology parameters were calculated and analyzed by cell survival curve fitting from multi-targetmodel，SF=1-（1-e-D/D0）N.Results Comparing with the control，The resistant substrain radiobiology parameter values were D0（1.9673，2.2756），N（1.0016，2.6008），Dq（0.6783，1.6860）and SF2（0.3623，0.7134）respectively.Cellmorphology ismore slender and hasmore tentacles.The SF2value of radiation-resistant subline is 1.97 timesmore than that ofwild cell line.The proportion of radiation-resistant cells in G2/M-phase was down to 7.84％，compared with the 18.52％ofwild cells.Conclusions A radiation-resistant SCLC subline NCI-H446-R is established andmay be a useful tool for studying resistant to radiation of SCLC in the future.

Radiation resistance；Small cell lung cancer；NCI-H446 cell line；Cell cycle

張偉（1964-），男，研究員，研究方向：主要從事轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。E-mail：zhangww1954@126.com。

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0051-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.012

劉靜（1984-），女，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：腫瘤細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。E-mail：liujingcicams@163.com。

﹞2015-08-18

研究報(bào)告