劉麗君,余柄廷,胡凝珠,孫曉梅,王 瑋,孫 靜,胡云章,李建芳

（1.昆明醫(yī)科大學，昆明 650500；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，昆明 650118；3.河北大學生命學院，河北保定 071000）

樹鼩糞便細菌分離培養(yǎng)與鑒定

劉麗君1,2,余柄廷3,胡凝珠2,孫曉梅2,王 瑋2,孫 靜2,胡云章2,李建芳2

（1.昆明醫(yī)科大學，昆明 650500；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，昆明 650118；3.河北大學生命學院，河北保定 071000）

目的 了解人工飼養(yǎng)樹鼩糞便菌群多樣性，為樹鼩的正常飼養(yǎng)繁殖和微生物質量控制標準化提供依據(jù)。方法 隨機采集10份樹鼩糞便樣品，利用有氧及厭氧培養(yǎng)基進行細菌分離培養(yǎng)，提取細菌基因組DNA后PCR擴增16SrRNA基因并測序鑒定。結果 本實驗從樹鼩糞便樣品中，經(jīng)有氧培養(yǎng)分離鑒定出25株、12種細菌，經(jīng)厭氧培養(yǎng)分離鑒定出25株、10種細菌，包括變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬。結論 樹鼩腸道好氧菌及厭氧菌具有豐富的種屬多樣性，普通變形桿菌群、費格森埃希菌群和屎腸球菌群可能是樹鼩腸道的主要寄生菌群。

樹鼩；糞便細菌；有氧培養(yǎng)；厭氧培養(yǎng)；分離鑒定

樹鼩（Tupaia belangeri，tree shrew）形態(tài)酷似松鼠，是種生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類的小型動物，具有體型小，繁殖能力強，易馴養(yǎng)，經(jīng)濟易得等優(yōu)點。研究表明樹鼩的許多分子和細胞結構近似于人類，新陳代謝與解剖結構比嚙齒類更接近于非人靈長類動物，常用于替代或減少一些非人靈長類動物的使用。樹鼩在腫瘤學、內分泌學、神經(jīng)生物學、生殖生物學、免疫學等方面已有廣泛和深入的研究，并對多種人類重要病毒易感，可作為重要人類病毒的動物模型［1]。

但由于以往研究所用的樹鼩多為野外捕獲的動物，還沒有實現(xiàn)樹鼩標準化，使得有些結果判定出現(xiàn)困難，如在動物感染率、感染維持時間、感染指標檢測等方面的穩(wěn)定性和重復性存在不足，致使一些學者提出質疑，很大程度上影響了研究的進展［2]。

普通級樹鼩在人工繁育過程中，曾有病原微生物所致樹鼩爆發(fā)腹瀉少數(shù)致死的情況，因此對排便正常的樹鼩，糞便中好氧及厭氧細菌的分離鑒定及分析，可為樹鼩的正常飼養(yǎng)繁殖和微生物質量控制標準化提供依據(jù)，對樹鼩的飼養(yǎng)繁殖和科學管理具有重要的現(xiàn)實意義［3]。

1 材料和方法

1.1 動物

10只健康來源于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心人工繁育普通級種群，生產(chǎn)許可證號【SCXK（滇）2013-0001】，使用許可證【SYXK（滇）2013-0001】。動物飼養(yǎng)溫度 22℃ ～25℃，濕度40％ ～60％，每日明暗交替照明12 h每天分別給予自制蒸料和商品化膨化犬料各一次，飲用城市供應的自來水。

1.2 設備與材料

Forma恒溫培養(yǎng)箱；BIO-RAD梯度PCR儀；蘇州凈化設備有限公司HT6029型超凈工作臺；其林貝爾儀器制造有限公司QL-901型漩渦混合器；恒溫搖床；三菱密閉式厭氧培養(yǎng)盒；三菱厭氧產(chǎn)氣袋；三菱厭氧指示劑；OXOID LB和腦心浸出液培養(yǎng)基；Promega-Wizard基因組DNA純化試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 樹鼩糞便的收集：抓取并保定樹鼩，多數(shù)樹鼩在抓取過程中因緊張而主動排出糞便，對無糞便者通過輕輕按摩其腹部使其排便，每只樹鼩采集豌豆粒大小新鮮糞便標本。

1.3.2 糞便樣品的混懸稀釋

將糞便樣品混懸到無菌生理鹽水中后以10倍遞增梯度稀釋。

1.3.3 細菌分離培養(yǎng)

選取適合的稀釋樣品涂布LB瓊脂平板和腦心浸出液瓊脂平板，分別做有氧和厭氧培養(yǎng)分離單菌落。

1.3.4 擴增16SrDNA片段

將分離到的單菌落接種到相應的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)擴增，用試劑盒抽提基因組 DNA，用細菌16SrRNA的通用引物27F 5′-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3′和 1492R 5′-TACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3′，PCR擴增細菌16SrDNA片段。

1.3.5 載體構建

將純化的16SrDNA片段構建到pGEM-T載體上，轉化細菌后篩選陽性克隆。

1.3.6 測序鑒定

將陽性克隆送到英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司做DNA測序。將得到的堿基序列輸入 NCBI GenBank做blast序列比對分析確定分離得到細菌的種屬。

2 結果

2.1 細菌16SrRNA基因PCR擴增結果

本試驗從10只無腹瀉等癥狀的正常樹鼩的糞便中，有氧和厭氧培養(yǎng)分別分離鑒定出25株、12種和25株、10種細菌，對分離菌株進行16SrRNA基因PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行10g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，在1500 bp處均出現(xiàn)一條明亮的目的條帶，如圖1、圖2。將PCR產(chǎn)物送測序，將測序結果與NCBI GenBank中參考菌株16SrRNA，基因核苷酸序列進行同源性分析比較，根據(jù)不同屬細菌16SrRNA基因同源性為70％～90％，而同一種內不同株間基因同源性大于99％的判定標準。有氧及厭氧培養(yǎng)分離到普通變形桿菌、糞腸球菌、費格森埃希菌、屎腸球菌、弗氏志賀菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、殺鮭氣單胞菌、水生拉恩氏菌、索氏志賀氏菌、土生拉烏爾菌、巴黎鏈球菌、腸系膜明串珠菌、水生微小桿菌等與NCBIGenBank中相關參考菌株16SrRNA基因的核苷酸序列同源性均在99％ ～100％之間，從而確定分離到的純培養(yǎng)菌株的種屬。

2.2 細菌總檢出數(shù)及檢出率

樹鼩糞便經(jīng)有氧和厭氧分離鑒定，檢出變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬，包括普通變形桿菌、屎腸球菌、費格森埃希菌、弗氏志賀菌、糞腸球菌、索氏志賀氏菌、土生拉烏爾菌、巴黎鏈球菌、水生拉恩氏菌、水生微小桿菌、腸系膜明串珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、殺鮭氣單胞菌共14種細菌，總檢出數(shù)及檢出率見表1。其中普通變形桿菌、屎腸球菌、費格森埃希菌、弗氏志賀菌檢出率達到50％。

圖1 有氧培養(yǎng)分離細菌16SrRNA PCR擴增結果Note：M.DNA Marker DL2000；1-12.PCR products of16SrRNA.Fig.1 PCR amplification of 16SrRNA which isolated bacterial strains by aerobic culture

圖2 厭氧培養(yǎng)分離細菌16SrRNA PCR擴增結果Note：M.DNA Marker DL2000；1-10.PCR products of16SrRNA.Fig.2 PCR amplification of16SrRNA which isolated bacterial strains by anaerobic culture

2.2.1 有氧培養(yǎng)分離鑒定結果

樹鼩糞便經(jīng)有氧培養(yǎng)分離鑒定得到的細菌主要有變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬，其中普通變形桿菌5株、糞腸球菌4株、費格森埃希菌3株、屎腸球菌3株、弗氏志賀菌2株、索氏志賀氏菌2株、大腸埃希菌1株、金黃色葡萄球菌1株、殺鮭氣單胞菌1株、水生拉恩氏菌1株、土生拉烏爾菌1株、水生微小桿菌1株。

2.2.2 厭氧培養(yǎng)分離鑒定結果

樹鼩糞便經(jīng)厭氧分離鑒定得到的細菌主要有埃希菌屬、志賀菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、變形桿菌屬、氣單胞菌屬、明串珠菌屬、拉烏爾菌屬，其中費格森埃希菌5株、屎腸球菌4株、弗氏志賀菌3株、索氏志賀氏菌3株、巴黎鏈球菌2株、糞腸球菌2株、普通變形桿菌2株、土生拉烏爾菌2株、腸系膜明串珠菌1株、殺鮭氣單胞菌1株。

3 討論

腸道正常菌群是經(jīng)過長期歷史進化在宿主內形成的定植微生物群落，他們對宿主是有益的和必需的，在正常狀態(tài)下是無害的。種類不同的腸道菌群按一定的比例組合，各菌間互相拮抗互相協(xié)同，在質和量上形成一種動態(tài)生物平衡。實驗結果顯示正常樹鼩糞便菌群的多樣性，間接說明樹鼩常態(tài)腸道寄生菌群的多樣性。

表1 培養(yǎng)細菌鑒定結果及檢出數(shù)與檢出率Tab.1 Identification results and detection number and detection rate of isolated bacterial strains.

在10只正常排便樹鼩的糞便樣品中，我們通過有氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)分離到 50株細菌，經(jīng)過16SrRNA的序列比對分析鑒定分離到細菌包含了變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬共11個屬，14種細菌。其中分離到的費格森埃希菌、弗氏志賀菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、屎腸球菌、索氏志賀氏菌、土生拉烏爾菌、殺鮭氣單胞菌等為兼性厭氧菌，在有氧和厭氧培養(yǎng)過程中均能分離得到。

根據(jù)分離培養(yǎng)結果，普通變形桿菌群、費格森埃希菌群和屎腸球菌群的檢出比例均達到60％，表明普通變形桿菌群、費格森埃希菌群和屎腸球菌群為樹鼩優(yōu)勢菌群，且可能是樹鼩腸道的主要寄生菌群。這些優(yōu)勢菌群與樹鼩的飲食習慣、生活習性和生理代謝等密切相關。

腸球菌屬的屎腸球菌和糞腸球菌是人和動物腸道內主要正常菌群。糞腸球菌其能產(chǎn)生天然抗生素，有利于機體健康同時還能產(chǎn)生細菌素等抑菌物質，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌具有良好的抑制作用，改善腸道微環(huán)境［4-5]。且有研究報道普通變形桿菌、費格森埃希菌等屬于條件致病菌，可存在于健康動物體內，當機體免疫力降低時，極易引起疾病的發(fā)生［6-8]。

本實驗對糞便樣品進行完全厭氧培養(yǎng)，另外得到腸系膜明串珠菌和巴黎鏈球菌，已廣泛應用于風味劑、血漿代用品的腸系膜明串珠菌，證實其能產(chǎn)生大量有機酸、醇類及各種氨基酸等代謝物，能拮抗致病菌，促進腸道益生菌的生長［9]。巴黎鏈球菌又稱嬰兒鏈球菌結腸亞種，是牛鏈球菌的一種。牛鏈球菌與結腸疾病有關［10]。到目前為止國內外報道的文獻中，對于巴黎鏈球菌的研究非常稀少，而這種菌株只從少數(shù)的臨床血、尿樣品以及非臨床的糞便樣品中分離到，因此該菌株的生物學特性尚不清楚，有待開展進一步的研究［11-12]。

所有樹鼩在采樣時雖然糞便色澤有所差異，但數(shù)周來均無拉稀腹瀉癥狀，大便正常，而且外觀健康，精神活動狀況良好，沒有治療用藥情況。因此，所檢出的普通變形桿菌、費格森埃希菌、志賀氏菌、殺鮭氣單胞菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等條件致病菌種［5-8，13]，可以初步判斷應為常態(tài)寄生菌種，這些條件致病菌的檢測監(jiān)控對于實驗樹鼩的健康管理、質量控制、日常飼養(yǎng)管理、疾病預防工作和將來生物凈化樹鼩種群的建立和生產(chǎn)提供指導具有一定的意義。

邢進、高家紅等［14-15]關于樹鼩腸道細菌的研究顯示，大腸桿菌菌群、葡萄球菌菌群及鏈球菌菌群的檢出率較高，與本實驗結果有較大差異。分析可能原因為本實驗檢測樣品為樹鼩的糞便，與活體樹鼩的肛門內取樣或剖殺樹鼩采集回盲部內容物的采樣不同，且本實驗增加嚴格厭氧培養(yǎng)，因而可分離獲得一些不常檢出的厭氧菌。

本實驗以溫和方式采集樹鼩糞便樣品，可減少對樹鼩的驚嚇及避免不必要的損傷。由于16SrRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩(wěn)定性、序列分析的重現(xiàn)性極高，應用16SrRNA作為分子指標，分類鑒定細菌具有快速、微量、準確、簡便的特點。但本實驗采用的分離培養(yǎng)方式是傳統(tǒng)的細菌鑒定方法，然而在人類微生物群系研究中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)部位的不同，在人體中約有20％ ～60％的細菌不能培養(yǎng)［16]。且有些細菌在糞便中可能豐度較低，或培養(yǎng)時間較長易遺漏，不易通過傳統(tǒng)方法分離，提示我們可利用454焦磷酸測序技術等對這些微生物進行高通量測序鑒定［17]，以便更加全面的檢測樹鼩糞便的微生物群系，為樹鼩的正常飼養(yǎng)繁殖和微生物質量控制標準化提供依據(jù)。

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Isolation，culture and identification of bacterial strains from tree shrews feces

LIU Li-jun，YU Bing-ting，HU Ning-zhu，SUN Xiao-mei，WANGWei，SUN Jing，HU Yun-zhang，LIJian-fang
（1.Kunming Medical University，Kunming 650500，China；2.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Kunming 650118，China；3.Hebei University，Hebei Baoding 071000，China）

Objective Study the fecal flora diversity of the tree shrew，to provide a basis data of fecal bacteria of feeding the tree shrew.M ethods Ten tree shrews were used in this study.The Stools of the animals were respectively cultured with oxygen and without oxygen to isolate the bacterial.Then the PCR-amplified 16S rRNA of the bacterial was sequenced and analyzed.Results 25 bacterial strains belonging to ten bacterial species were isolated by anaerobic incubation，and 25 bacterial strains belonging to twelve bacterial species were isolated by aerobic incubation.Proteus vulgaris，Enterococcus faecalis， Escherichia fergusonii， Enterococcus faecium， Shigella flexneri， Shigella sonnei，Staphylococcus aureus，Aeromonas salmonicida subsp.masoucida，Rahnella aquatilis，Exiguobacterium aquaticum，Raoultella terrigena，and Escherichia coliwere identified in this study.Conclusions There is a fecal flora diversity of the tree shrew，and the Proteus vulgaris，Escherichia fergusonii and Enterococcus faecium may be themajor parasitic flora.

Tree shrew；Faecal bacteria；Aerobic culture；Anaerobic culture；Isolation identification

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0064-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.015

國家科技支撐計劃項目（2014BAI01B01）；云南省社會發(fā)展新藥專項（2013BC011）。

劉麗君（1990-），女，碩士生，專業(yè)：生物化學與分子生物學。

李建芳（1982-），女，助理研究員，E-mail：jianfangli@126.com。

﹞2015-08-31

技術方法