戴 雯,李 艷,鄭紅云,許淑文

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，武漢 430000）

雌雄激素聯(lián)合作用對高脂血癥小鼠血脂水平及凝血功能的影響

戴 雯,李 艷,鄭紅云,許淑文

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，武漢 430000）

目的 探討雌雄激素聯(lián)合作用對高脂血癥小鼠血脂水平及凝血功能的影響。方法 對小鼠行去勢手術(shù)后通過高脂飲食建立高脂血癥模型，通過給予不同激素將老鼠分為5組。造模結(jié)束后采集小鼠血液，一部分小鼠分離血清檢測小鼠血脂水平，一部分小鼠分離血漿檢測凝血功能。結(jié)果 高脂飲食后，小鼠血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平較對照組相比明顯升高，凝血酶原時間、活化部分凝血酶原時間時間明顯縮短（P＜0.05），給予雌雄激素聯(lián)合治療后，與造模組相比，小鼠血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平較對照組相比明顯下降，凝血酶原時間、活化部分凝血酶原時間時間明顯延長（P＜0.05），而與對照組無明顯差異。結(jié)論 雌雄激素聯(lián)合治療可以調(diào)節(jié)血脂，顯著降低低密度脂蛋白的水平，調(diào)節(jié)凝血功能，提示雌雄激素聯(lián)合作用可以降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險，為冠心病的激素治療提供新思路。

雌激素；雄激素；高脂血癥；凝血功能

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是日益突出的公共健康問題。雌激素替代治療是基于雌激素對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用的治療方案，曾被嘗試用于治療冠心病，但是大規(guī)模的臨床試驗表明，雌激素替代治療使凝血功能增強(qiáng)，增加靜脈血栓和腦卒中的風(fēng)險，因而建議停止使用［1]。雄激素作為現(xiàn)今激素的研究的熱點(diǎn)，為激素替代治療提供了新思路。實驗研究結(jié)果顯示，睪酮（testosterone，T）可以有效降低促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α水平，并增加抗炎細(xì)胞因子I-4和IL-10水平［2]，并可提高纖維蛋白溶解系統(tǒng)及抗凝血酶Ⅲ的活性起到強(qiáng)大的抗血栓作用，延緩動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的病理進(jìn)程，降低血栓形成和卒中的風(fēng)險［3]。分析雌雄激素心血管系統(tǒng)中的利弊，為雌雄激素聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)。高脂血癥是CHD發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，本研究擬在動物學(xué)水平探討雌雄激素聯(lián)合作用對高脂血癥小鼠血脂水平及凝血功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物模型的建立

本研究所選用的SPF級C57BL/6雌性小鼠購于武漢大學(xué)實驗動物中心【SCXK（鄂）2014-0004】。無菌手術(shù)與動物飼養(yǎng)及給藥均在武漢大學(xué)實驗動物中心生物安全三級動物實驗室內(nèi)進(jìn)行【SYXK （鄂）2014-0013】。對8周齡雌鼠進(jìn)行分組，主要分為對照組和去勢組。去勢組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)（ovariectomy，OVX）。OVX2周后，對小鼠進(jìn)行剪尾采血。檢測小鼠血清雌雄激素的水平，判斷卵巢切除是否成功。在10周齡時，將小鼠分為以下5組：

A：對照組（n=10）

B：單純造模組（n=10）

C：造模+雌激素組（n=10）

D：造模+雄激素組（n=10）

E：造模+最適雌雄激素比例組（n=10）

BCDE為去勢組。對照組給予正常飲食喂養(yǎng)；單純造模組給予高脂飲食（high fat diet，HD）（基礎(chǔ)飼料77.8％，蔗糖2％，豬油10％，膽固醇2％，膽鹽0.2％）喂養(yǎng)；造模+雌激素組在給予高脂飲食喂養(yǎng)的同時，對小鼠進(jìn)行雌二醇（estradiol，E2）（1μg/d）灌胃治療；造模+雄激素組在給予高脂飲食喂養(yǎng)的同時，對小鼠進(jìn)行睪酮（7μg/d）灌胃治療；造模+雌雄激素聯(lián)合組在給予高脂飲食喂養(yǎng)的同時，對小鼠進(jìn)行雌激素（1μg/d）和睪酮（7μg/d）聯(lián)合灌胃治療。造模與治療持續(xù)14周。

1.2 小鼠血清與血漿取材

造模與治療持續(xù)14周后，摘小鼠眼球，盡可能多的收集血液。每組中5只小鼠的血液收集至促凝的采血管中，用于分離血清；另5只小鼠的血液收集至枸櫞酸鈉抗凝（血液與抗凝劑的比例約為9∶1）的采血管中，用于分離血漿，進(jìn)行凝血相關(guān)檢查。

1.3 血清指標(biāo)與凝血功能檢測

小鼠雌、雄激素的檢測采用ELISA方法。商品化小鼠雌二醇與睪酮檢測試劑盒購于上海博谷生物公司。血脂的檢測使用西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。凝血功能的檢測使用sysmex CA7000全自動凝血分析儀進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組數(shù)據(jù)間比較應(yīng)用 one-way ANOVA和Student-Newman-KeμLs q檢驗，以P＜0.05為差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況分析

從表1可知，給予小鼠高脂飲食喂養(yǎng)后，體重明顯增加（P＜0.05）。對高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠單純的給予E2或T治療，并不會使體重減輕（P＜0.05）。然而，給予雌雄激素聯(lián)合治療組小鼠體重與造模組相比明顯下降，與對照組小鼠體重?zé)o明顯差異。

行OVX后，造模組血清E2和T水平較對照組均明顯下降（P＜0.05）。對小鼠進(jìn)行1μg/d E2灌胃給藥后，小鼠血清E2水平明顯升高（P＜0.05）；對小鼠進(jìn)行7μg/d T灌胃給藥后，小鼠血清T水平，明顯升高（P＜0.05）；而對小鼠進(jìn)行1μg/d E2 +7μg/d T聯(lián)合給藥時，小鼠血清E2和T的水平均明顯升高（P＜0.05），這提示通過灌胃給予小鼠E2和T治療可以調(diào)節(jié)小鼠血清E2和T水平，證明給藥有效。

2.2 雌雄激素聯(lián)合作用對小鼠血脂的影響

如表2所示，與對照組相比，造模組血清TC、TG和LDL水平明顯升高（P＜0.05），HDL水平明顯降低（P＜0.05）。而雌雄激素聯(lián)合治療中小鼠血清TG和HDL水平升高，TC和LDL明顯降低。這提示，雌雄激素聯(lián)合治療時對小鼠血脂具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

表1 小鼠的一般情況分析（±s）Tab.1 General features of experimental animals（±s）

表1 小鼠的一般情況分析（±s）Tab.1 General features of experimental animals（±s）

注：*與對照組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Note：*Compared with control，P＜0.05.

對照組Control （n=9）造模組OVX+HD （n=9）雌激素組OVX+HD+E2 （n=9）雄激素組OVX+HD+T （n=10）雌雄激素聯(lián)合組OVX+HD+E2+T （n=9）體重Body weight（g） 22.13±0.25 46.75±0.79* 32.28±1.21* 44.68±0.86* 25.46±0.44雌二醇濃度E2（ng/ml） 2.63±0.51 1.96±0.34* 3.74±0.47* 2.16±0.98 5.37±1.72*睪酮濃度T（ng/ml） 13.00±1.52 12.48±1.40* 13.56±0.51 19.32±4.31* 15.32±2.76*雌雄比值E2/T ratio 0.19±0.09 0.16±0.02* 0.28±0.04* 0.11±0.04* 0.35±0.05*

表2 不同組小鼠血脂水平檢測（±s）Tab.2 The level of plasma lipids inmice（±s）

表2 不同組小鼠血脂水平檢測（±s）Tab.2 The level of plasma lipids inmice（±s）

注：*與對照組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；#與造模組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Note：*Compared with control，P＜0.05；#Compared with OVX+HD，P＜0.05.

TC（mmol/L） TG（mmol/L） HDL（mmol/L） LDL（mmol/L）對照組Control 2.43±0.08 1.18±0.17 1.26±0.06 0.41±0.01造模組OVX+HD 3.59±0.23* 2.10±0.29* 0.98±0.06* 0.52±0.05*雌激素組OVX+HD+E2 3.41±0.25* 0.74±0.16*# 1.17±0.01 0.34±0.03*#雄激素組OVX+HD+T 4.42±0.11* 2.15±0.37* 1.88±0.20*# 0.46±0.03#雌雄激素聯(lián)合組OVX+HD+E2+T 4.30±0.14* 1.14±0.24# 2.17±0.12*# 0.27±0.06*#

2.3 雌雄激素協(xié)同作用對小鼠血漿凝血指標(biāo)的影響

凝血功能在動脈粥樣硬化中具有重要作用，而目前對于激素替代治療中對凝血功能的影響存在廣泛爭議，因此在本研究中我們用凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和活化部分凝血酶原時間（activated partial thromboplastin time，APTT）來評價小鼠的凝血功能。結(jié)果如圖1、2所示，與對照組相比，造模組小鼠PT與APTT明顯縮短（P＜0.05），單純E2治療組中 PT明顯延長 APTT明顯縮短（P＜0.05）。然而雌雄激素聯(lián)合治療組中 PT和APTT時間恢復(fù)到對照水平，與對照組無差異。

3 討論

圖1 雌雄激素對小鼠PT的影響Note：*Compared with control，P＜0.05；#Compared with OVX+HD，P＜0.05.Fig.1 The influence of estradiol combined testosterone on PT inmice

雌激素替代治療，已有幾十年的歷史，但結(jié)果存在廣泛爭議。大部分基礎(chǔ)研究證實雌激素可以通過舒張血管、調(diào)節(jié)血脂、抗炎效應(yīng)等對心血管具有保護(hù)保護(hù)作用。然而隨著研究的深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)為，單純給予雌激素不能完全預(yù)防和治療女性冠心病。臨床試驗匯萃分析顯示，口服雌激素可增加凝血因子VII，降低血纖維蛋白原、纖溶酶原激活物抑制劑1［4]。這種治療可能增加靜脈血栓栓塞或腦卒中的風(fēng)險。WHI（women health initiative）的研究結(jié)果也認(rèn)為：雌激素聯(lián)合孕激素治療會增加冠心病、中風(fēng)和肺栓塞發(fā)病危險性，并建議停止使用。由此可見無論是雌激素替代治療還是雌/孕激素聯(lián)合治療CHD效果均不理想。

圖2 雌雄激素對小鼠APPT的影響Note：*Compared with control，P＜0.05；#Compared with OVX+HD，P＜0.05.Fig.2 The influence of estradiol combined testosterone on APPT inmice

針對雌激素治療冠心病的不足，越來越多的研究者開始研究雄激素對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。雄激素尤其是睪酮可通過代謝產(chǎn)物間接和直接影響人類脈管系統(tǒng)，進(jìn)而對心血管起到積極的保護(hù)作用［5]。大量實驗研究結(jié)果一致認(rèn)為：睪酮可以有效降低促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF、IFN-γ水平，增加抗炎細(xì)胞因子-IL-4與IL-10水平。此外，睪酮自身作為免疫抑制劑可調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)。一方面可激活血栓素A2受體及血小板聚集，另一方面可提高纖維蛋白溶解系統(tǒng)及抗凝血酶III的活性起到抗血栓、抗心絞痛的作用［3]。睪酮強(qiáng)大的抗血栓作用可顯著延緩AS病理進(jìn)程并降低其發(fā)生靜脈血栓甚至中風(fēng)的危險。

國內(nèi)外最新研究已開始關(guān)注雌雄激素聯(lián)合治療在動物疾病模型中的應(yīng)用。有研究表明在雌雄激素在前列腺增生中發(fā)揮了重要的作用［6]。只有當(dāng)雌雄激素比例為1∶100時，才能在去勢大鼠的體內(nèi)明顯減少前列腺基質(zhì)的改變。另一個研究關(guān)注了雌雄激素平衡與腦血管系統(tǒng)的關(guān)系［7]。他們的研究發(fā)現(xiàn)，不同比例的雌雄激素對腦血管的血管功能、內(nèi)皮功能、氧化應(yīng)激和炎癥有不同的影響。同時也有研究已初步觀察雌激素聯(lián)合雄激素治療對絕經(jīng)后婦女心血管系統(tǒng)的影響。隨機(jī)雙盲研究顯示［8]：絕經(jīng)后婦女給予雌二醇（2 mg）聯(lián)合睪酮（40 mg）（E2/T）治療24周后檢測CHD高危因子-CRP，IL-6、TNF-α、VCAM-1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：E聯(lián)合T治療可明顯降低CRP水平。因此，研究雌雄激素協(xié)同作用對動脈粥樣硬化的影響，對絕經(jīng)后女性CHD的防治具有重要意義。

通過本研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，雌雄激素聯(lián)合作用可以明顯降低高脂飲食誘導(dǎo)到的體重減輕。同時，也可以調(diào)節(jié)血脂，顯著降低LDL-C的水平，提示雌雄激素聯(lián)合作用可以降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險。

雖然，大多數(shù)研究表明雌激素具有抗動脈粥樣硬化效應(yīng)。然而，臨床研究顯示E2可紊亂凝血功能［9]，增加血液粘度、增加血栓發(fā)生的風(fēng)險，這也是公認(rèn)的雌激素替代治療失敗的主要原因。本研究在早期動脈粥樣硬化模型小鼠中給予生理劑量的E2后，發(fā)現(xiàn)小鼠的PT時間明顯延長而APTT時間明顯縮短，這提示小鼠的內(nèi)源性和外源性凝血途徑均紊亂，為雌激素替代治療的不良反應(yīng)提供了理論依據(jù)。近期有一項研究表明睪酮可以抑制血栓形成［10]。這提示睪酮可以抵抗雌激素紊亂凝血功能的不良效應(yīng)，為雌雄激素聯(lián)合治療提供了理論基礎(chǔ)。

也有不少研究表明睪酮替代治療對雄鼠的動脈粥硬化具有保護(hù)作用。然而，極少有睪酮替代治療在OVX雌鼠中的研究。本研究結(jié)果顯示，與單純E2治療相比，給予小鼠單純T治療對小鼠的凝血功能具有相反的效應(yīng)。然而，在給予雌雄激素聯(lián)合治療時，小鼠的凝血功能得到了糾正。這也充分體現(xiàn)了雌雄激素聯(lián)合治療的互補(bǔ)作用。

在本研究中，雌雄激素聯(lián)合治療可有效的調(diào)節(jié)血脂及凝血功能，而且這些效應(yīng)明顯優(yōu)于單純雌二醇或睪酮治療。這提示在早期動脈粥樣硬化模型中雌激素與雄激素具有協(xié)同作用，雌雄激素聯(lián)合治療可明顯抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展?？偠灾?，本研究為雌雄激素聯(lián)合治療提供了實驗基礎(chǔ)，為冠心病的防治提供新思路。

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The synergistic effect of estradiol and testosterone on the lipids and coagulation function in m ice w ith hyperlipidem ia

DAIWen，LIYan，ZHENG Hong-yun，XU Shu-wen
（Renmin Hospital ofWuhan University，Department of clinical laboratory，Wuhan 430000，China）

Objective To investigate the influence of synergistic effect of estradiol and testosterone on the level of lipids and coagulation function inmice with hyperlipidemia.M ethods We established amaousemodel in hyperlipidmia，giving estradiol（1 μg/d），testosterone（7μg/d）or estradiol combined testosterone（1 μg/d E2+7Tμg/d），respectively.After 14 weeks，we collected the blood from the mice，separated the serum to detect the lipids level，separated the plasma to test the coagulation function.Result Compared with controls，after high-fat diet，the serum level of total cholesterol（TC），triglyceride（TG），high density lipoprotein（HDL）were significantly increased，PT and APTT were shorter（P＜0.05）.However，after treating with estradiol combined testosterone，compared with cases，the serum level of C，TG and HDL were lower and PT，APTT were longer（P＜0.05），had no significance with controls.Conclusion The synergistic effect of estradiol and testosterone canmediate the lipids，reduce the level of LDL，regulate the coagulation function，reduce the risk of coronary heart disease，and also provide a new strategy for hormone therapy in coronary heart disease.

Estrogen；Androgen；Hyperlipidemia；Coagulation function

李艷（1961-），女，教授，研究方向：激素調(diào)節(jié)與冠心病的防治。Email：yanlitf1120@163.com。

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0029-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.007

武漢大學(xué)自主科研項目（410500191）。

戴雯（1987-），女，博士生，研究方向：激素調(diào)節(jié)與冠心病的防治。Email：diane919@qq.com。

﹞2015-07-14

研究報告